«Детская школа искусств» Мошенского муниципального района

М и моро 2 класс: ГДЗ по математике 2 класс учебник Моро 1, 2 часть

Содержание

ГДЗ по математике 2 класс учебник Моро, Волкова 2 часть

Номер 1.

1) Делимое 6, делитель 3. Найди частное.
2) Найди частное чисел 12 и 6.

1) 6 : 3 = 2 2) 12 : 6 = 2

Номер 2.

Реши задачи и сравни решения.
1) Юля посадила 18 луковиц в 3 ряда поровну. Сколько луковиц в каждом ряду?
2) Вера посадила 18 луковиц, по 3 луковицы в ряд. Сколько получилось рядов?

Задача 1:

18 : 3 = 6 (л.) – в каждом ряду. Ответ: 6 луковиц
Задача 2:

18 : 3 = 6 (р.) – всего. Ответ: 6 рядов.
Решения задач внешне не различаются, но имеют разный смысл.

Номер 3.

Реши задачи и сравни решения.
1) Отрезок длиной 12 см разделили на 2 равные части. Чему равна длина каждой части?
2) Отрезок длиной 12 см разделили на части, по 2 см каждая. Сколько получилось частей?

Задача 1:

12 : 2 − 6 (см) – длина одной части. Ответ: 6 см.
Задача 2:

12 : 2 = 6 (ч.) – всего. Ответ: 6 частей.
Решения задач внешне не различаются, но имеют разный смысл.

Номер 4.

Составь две задачи, похожие на предыдущие, по их решению: 8 : 4.

Задача 1: Маша поделила 8 конфет между четырьмя своими подругами. Сколько конфет получила каждая подружка? 8 : 4 = 2 (к.) – у одной девочки. Ответ: 2 конфеты.
Задача 2: Бабушка на тарелки разложила 8 яблок по 4 на каждую. Сколько тарелок понадобилось бабушке? 8 : 4 = 2 (т.) – всего. Ответ: 2 тарелки.

Номер 5.

Для ремонта квартиры купили 10 банок краски, 7 банок израсходовали. Сколько банок с краской осталось? На сколько больше банок краски израсходовали, чем осталось?

1) 10 − 7 = 3 (б.) – красок осталось. 2) 7 − 3 = 4 (б.) – разница. Ответ: на 4 банки больше.

Номер 6.

Реши уравнения: x − 9 = 7, x + 30 = 70.

Номер 7.

В каждом столбике найди значения второго выражения, используя значение первого.

1) 9 ∙ 7 = 63     7 ∙ 10 = 70      15 ∙ 4 = 60     9 ∙ 8 = 72     7 ∙ 9 = 63        15 ∙ 5 = 75
2) 12 ∙ 4 = 48     14 ∙ 5 = 70     18 ∙ 4 = 72     12 ∙ 5 = 60     14 ∙ 4 = 56     18 ∙ 3 = 54

Номер 8.

Задание на полях страницы

Магические квадраты

Задание внизу страницы

Проверочные работы с.58 Проверочные работы с.59

ГДЗ по математике 2 класс учебник Моро, Волкова 2 часть

Номер 1.

Вычисли произведения, заменяя умножение сложением одинаковых слагаемых.

9 ∙ 2 = 9 + 9 = 18
2 ∙ 3 = 2 + 2 + 2 = 6
1 ∙ 5 = 1 + 1 + 1 + 1 + 1 = 5
0 ∙ 4 = 0 + 0 + 0 + 0 = 0
12 ∙ 2 = 12 + 12 = 24

Номер 2.

8 + 8 + 8 > 8 ∙ 2        8 ∙ 3 > 8 ∙ 2
4 ∙ 5 > 4 + 4 + 4 + 4 4 ∙ 5 > 4 ∙ 4
6 + 6 + 6 + 6 + 6 = 6 ∙ 5                    6 ∙ 5 = 6 ∙ 5
1 ∙ 3 < 1 + 1 + 1 + 1 1 ∙ 3 < 1 ∙ 4

Номер 3.

В каждой бутылке по 2 л лимонада. Сколько литров лимонада в четырех бутылках? в трех?

1 бутылка – 2 л 4 бутылки – ? л 3 бутылки – ? л 1) 2 ∙ 4 = 2 + 2 + 2 + 2 = 8 (л) – в четырех бутылках. 2) 2 ∙ 3 = 2 + 2 + 2 = 6 (л) – в трёх бутылках. Ответ: 8 литров и 6 литров.

Номер 4.

В бидоне 30 л молока. Из него налили молоко в банки: в одну 5 л, в другую 3 л. Сколько литров молока осталось в бидоне?
Реши задачу разными способами.

Было – 30 л Вылили – 5 л и 3 л Осталось – ? л
1 способ: 1) 5 + 3 = 8 (л) – вылили. 2) 30 − 8 = 22 (л) Ответ: 22 л молока осталось.
2 способ: 1) 30 − 5 = 25 (л) – осталось сначала. 2) 25 − 3 = 22 (л) Ответ: 22 литра молока осталось.

Номер 5.

Длина одной стороны прямоугольника 4 см, другой – на 3 см меньше. Найди периметр этого прямоугольника.

Номер 6.

90 − 36 = 54    56 + 28 = 84
83 + 15 = 98    49 − 18 = 31

Номер 7.

Задание внизу страницы

На сколько больше лапок у 6 цыплят, чем ног у одной лошади?

1) 2 ∙ 6 = 12 (л.) – у шести цыплят. 2) 12 − 4 = 8 (л.) – разница. Ответ: на 8 лапок больше.

Задание на полях страницы

Начерти и раскрась узор

Поурочные разработки. Математика 2 класс. ФГОС./ К УМК М.И. Моро (Школа России) - Ситникова Т.Н. | 978-5-408-05099-4

Стоимость товара может отличаться от указанной на сайте!
Наличие товара уточняйте в магазине или по телефону, указанному ниже.

г. Воронеж, площадь Ленина, д.4

8 (473) 277-16-90

г. Липецк, проспект Победы, 19А

8 (4742) 22-00-28

г. Воронеж, ул. Маршака, д.18А

8 (473) 231-87-02

г. Липецк, пл.Плеханова, д. 7

8 (4742) 47-02-53

г. Богучар, ул. Дзержинского, д.4

8 (47366) 2-12-90

г. Воронеж, ул. Г. Лизюкова, д. 66 а

8 (473) 247-22-55

г.Поворино, ул.Советская, 87

8 (47376) 4-28-43

г. Воронеж, ул. Плехановская, д. 33

8 (473) 252-57-43

г. Воронеж, ул. Ленинский проспект д.153

8 (473) 223-17-02

г. Нововоронеж, ул. Ленина, д.8

8 (47364) 92-350

г. Воронеж, ул. Хользунова, д. 35

8 (473) 246-21-08

г. Россошь, Октябрьская пл., 16б

8 (47396) 5-29-29

г. Россошь, пр. Труда, д. 26А

8 (47396) 5-28-07

г. Лиски, ул. Коммунистическая, д.7

8 (47391) 2-22-01

г. Белгород, Бульвар Народный, 80б

8 (4722) 42-48-42

г. Курск, пр. Хрущева, д. 5А

8 (4712) 51-91-15

г. Губкин, ул. Дзержинского,д. 115

8 (47241) 7-35-57

г.Воронеж, ул. Жилой массив Олимпийский, д.1

8 (473) 207-10-96

г. Калач, пл. Колхозного рынка, д. 21

8 (47363) 21-857

г. Воронеж, ул.Челюскинцев, д 88А

8 (4732) 71-44-70

г. Старый Оскол, ул. Ленина, д.22

8 (4725) 23-38-06

г. Воронеж, ул. Ростовская, д,58/24 ТЦ «Южный полюс»

8 (473) 280-22-42

г. Воронеж, ул. Пушкинская, 2

8 (473) 300-41-49

г. Липецк, ул.Стаханова,38 б

8 (4742) 78-68-01

г.Старый Оскол, мкр Олимпийский, д. 62

8 (4725) 39-00-10

г. Воронеж, Московский пр-т, д. 129/1

8 (473) 269-55-64

ТРЦ «Московский Проспект», 3-й этаж

рефлекс Моро | UF Health, University of Florida Health

Определение

Рефлекс - это тип непроизвольной (непроизвольной) реакции на стимуляцию. Рефлекс Моро - один из многих рефлексов, наблюдаемых при рождении. Обычно он проходит через 3 или 4 месяца.

Альтернативные имена

Реакция запуска; Рефлекс вздрагивания; Принять рефлекс

Соображения

Лечащий врач вашего ребенка проверит этот рефлекс сразу после рождения и во время осмотров ребенка.

Чтобы увидеть рефлекс Моро, ребенка кладут лицом вверх на мягкую поверхность.

Голову осторожно поднимают с достаточной опорой, чтобы только начать снимать вес тела с подушки. (Примечание: тело младенца не следует поднимать с подушки, снимается только груз.)

Затем голова резко отпускается, ей дают возможность на мгновение откинуться назад, но быстро снова поддерживают (не разрешается стучать по подушке) .

Нормальная реакция ребенка - испуганный взгляд.Руки ребенка должны двигаться в стороны ладонями вверх и согнутыми большими пальцами. Ребенок может плакать минуту.

Когда рефлекс заканчивается, младенец подтягивает руки к телу, сгибает локти, а затем расслабляется.

Причины

Это нормальный рефлекс, присутствующий у новорожденных.

Отсутствие рефлекса Моро у младенца является ненормальным.

  • Отсутствие с обеих сторон предполагает повреждение головного или спинного мозга.
  • Отсутствие только на одной стороне указывает на перелом плечевой кости или повреждение группы нервов, идущих от нижней части шеи и верхней части плеча к руке (эти нервы называются плечевым сплетением).

Рефлекс Моро у младенцев старшего возраста, детей или взрослых является ненормальным.

Чего ожидать при посещении офиса

Медработник чаще всего обнаруживает аномальный рефлекс Моро. Врач проведет медицинский осмотр и спросит о истории болезни ребенка. Вопросы по истории болезни могут включать:

  • История родов и родов
  • Подробный семейный анамнез
  • Другие симптомы

Если рефлекс отсутствует или ненормален, могут потребоваться дополнительные тесты для исследования мышц и нервов ребенка.Диагностические тесты в случае снижения или отсутствия рефлекса могут включать:

Изображения



Ссылки

Schor NF. Неврологическое обследование. В: Kliegman RM, St. Geme JW, Blum NJ, Shah SS, Tasker RC, Wilson KM, ред. Учебник педиатрии Нельсона . 21-е изд. Филадельфия, Пенсильвания: Эльзевьер; 2020: глава 608.

Volpe JJ. Неврологическое обследование: нормальные и патологические особенности. В: Volpe JJ, Inder TE, Darras BT, et al, eds. Неврология новорожденных Вольпе .6-е изд. Филадельфия, Пенсильвания: Эльзевьер; 2018: глава 9.

Повышение урожайности и биологической активности растворимых молекул MHC класса II на основе типа «выступ в отверстие»

Система экспрессии растворимого pMHC класса II у млекопитающих

Мы использовали лентивирусные векторы, кодирующие IRES-CFP или IRES-EGFP. репортерные кассеты (рис. 1а) для экспрессии pMHCII в клетках СНО. Α- и β-цепи pMHCII были либо транскрибированы с одной ORF как две цепи, разделенные рибосомной пропускающей последовательностью P2A (рис. 1b), либо с двух разных ORF в разных векторах (рис.1в). Рисунки 2–4 суммируют структурные особенности репрезентативных конструкций для различных pMHCIIs, описанных здесь, а также ключевые соединительные последовательности. В таблице 1 представлен список использованных здесь мышиных и человеческих pMHCII и их выходы экспрессии. Вкратце, трансдуцированные клетки CHO-S, экспрессирующие высокие уровни EGFP и CFP, были отсортированы с помощью проточной цитометрии и выращены в среде, не содержащей белков, во встряхиваемых колбах с использованием протокола партии с подпиткой. pMHCII очищали от супернатантов и использовали непосредственно для покрытия наночастиц оксида железа (НЧ) или биотинилировали для получения тетрамеров pMHCII.

Фиг. 1 Конструкция конструкции для экспрессии

pMHCII. На рисунках изображена общая структура лентивирусной системы ( a ) и тип используемых конструкций ( b , c ). b Структура P2A-связанной конструкции, кодирующей цепь pMHCβ и MHCα (вверху) и изображение полученного продукта pMHCII, секретируемого в супернатант клеточной культуры (внизу). c Конструкции с одиночной цепью pMHCβ или MHCα, которые были последовательно трансдуцированы в клетки CHO для получения полученных гетеродимеров pMHCII αβ (внизу)

Рис.2

Ключевые соединительные, линкерные и мотивные последовательности для захваченного cys pMHCII человека и pMHCII мыши на основе mKIH. a Ключевые аминокислотные последовательности молекул pMHCII человека, кодирующих цис-ловушку IGRP 13–25 / DRA1 * 0101 / DRB1 * 0301 pMHCII, гетеродимеризованную через лейциновые молнии c-jun / c-fos (также называемые «обычными») . «…» Используется для обозначения того, что соответствующие промежуточные аминокислотные последовательности не показаны, поскольку они общедоступны. Остатки, выделенные красным, являются мутированными, и исходный остаток и его положение указаны непосредственно ниже. b Ключевые аминокислотные последовательности молекулы pMHCII мыши, кодирующей BDC2.5mi / IAα d / IAβ g7 , гетеродимеризованные с использованием карбоксиконцевого мышиного IgG1-Fc на основе KIH

Рис. 3

Ключевой соединительный элемент, линкер и мотив последовательности для pMHCII мыши на основе hKIH и пустой pMHCII на основе hKIH человека. a Ключевые аминокислотные последовательности молекулы pMHCII мыши, кодирующей BDC2.5mi / IAα d / IAβ g7 , гетеродимеризованные с использованием карбоксиконцевого человеческого IgG1-Fc на основе KIH. b Ключевые аминокислотные последовательности для «пустых» человеческих молекул MHCII, кодирующих DRA * 0101 MHCα и DRB1, DRB3, DRB4 или DRB5 MHCβ цепи, гетеродимеризованные с использованием карбоксиконцевого человеческого IgG1-Fc на основе KIH

Рис. структура основанных на KIH конструкций pMHCII или специфических доменов. Слева: первичная структура гетеродимера pMHCII на основе Cys-захваченного KIH. Вверху справа: вторичная структура пептид-связывающего домена, нагруженного пептидом, связанным с молекулой MHCII в определенном регистре через дисульфидный мостик между карбоксиконцевым концом пептида и комплементарным Cys на α-цепи MHCII.Внизу справа: предсказанная четвертичная структура части KIH Fc конструкций на основе KIH и ключевые аминокислотные замены, которые были использованы для стимулирования гетеродимеризации на основе KIH

Таблица 1 Пептиды, молекулы MHC, домены гетеродимеризации и выходы

Leucine zipper- на основе pMHCII имеют переменную стабильность

Было показано, что эпитоп является основным стабилизатором растворимых гетеродимеров pMHCII 10,11 . Связывание пептидов с высоким сродством поддерживает более высокую стабильность гетеродимера, чем пептиды, связывающиеся с низким сродством.Однако внутренние молекулярные свойства аллельных молекул MHCII также играют важную роль в определении стабильности pMHCII, независимо от пептида 12,13 . В результате, в то время как некоторые молекулы pMHCII мигрируют как единые крупные молекулярные частицы в неденатурирующем SDS-PAGE, большинство других молекул плавятся в одиночные α- и β-цепи (рис. 5a) и экспрессируются с низкими выходами (таблица 1).

Рис. 5

Стабилизация гетеродимеров pMHCII путем введения Cys-ловушек пептид-цепь MHCα. a SDS-PAGE для различных гетеродимеров pMHCII на основе c-jun / c-fos, несущих или лишенных Cys-ловушек (СТ), в нативных и денатурирующих условиях. 1: BDC2.5mi / IA g7 ; 2: ИГРП 13–25 / DR3; 3: PPI (76–90) (88S) / DR4; 4: ИГРП 23–35 / DR4; 5: Topo 722–736 / IAb; 6: ApoB 3501–3516 / IA b ; 7: DSG3 301–315 / IA b . MW, маркеры молекулярной массы. За исключением ApoB 3501–3516 / IA b , все остальные показанные гетеродимеры pMHCII частично или полностью нестабильны в отношении SDS.Электрофоретическое поведение различных pMHC, показанных здесь, соответствовало таковым, наблюдаемым с более ранними препаратами тех же белков, которые ранее запускались в отдельных гелях по крайней мере один раз. Они были повторно экспрессированы, повторно очищены и повторно запущены вместе, чтобы получить эту цифру. b Влияние Cys-захвата на SDS-стабильность гетеродимеров pMHCII. Данные соответствуют 1: IGRP 13–25 / DR3-non-CT; 2: ИГРП 13–25 / DR3-CT; 3: IGRP 23–35 / DR4-non-CT; 4: ИГРП 23–35 / DR4-CT; 5: PPI 76–90 (88S) / DR4-non-CT; и 6: Glia 62–72 / DQ2-CT. c pMHCII тетрамер / CD4 точечные диаграммы FACS для клеток Jurkat, экспрессирующих человеческий CD4 и IGRP 13–25 / DR3-специфический TCR (вверху) или мышиный CD4 и BDC2.5mi / IA g7 -специфический TCR (внизу ) окрашены не-CT (слева) или CT (справа) тетрамером IGRP 13–25 / DR3. Представленные образцы окрашивания являются репрезентативными, по крайней мере, для двух независимых экспериментов.

Cys-захваченные гетеродимеры pMHCII увеличивают стабильность pMHC

Мы пришли к выводу, что мы могли бы повысить стабильность и, возможно, продуктивность SDS-нестабильных c-jun / c-fos, закрепленных на застежке-молнии. MHCII (здесь также называемые `` обычные '') путем введения цистеинов в соответствующие положения в пептиде и α-цепи MHCII, чтобы закрепить пептид на MHC в предпочтительном регистре связывания 14,15 (в данном документе называется цис-улавливанием ( КТ)).Мы отмечаем, что наши предыдущие попытки решить эту проблему путем введения искусственных дисульфидных связей на или рядом с застежкой-молнией c-jun / c-fos в плохо экспрессирующие конструкции pMHCII были безуспешными. Сначала мы сосредоточились на связанном с диабетом 1 типа (T1D) комплексе IGRP 13–25 / DRB1 * 0301 / DRA1 * 0101 (Таблица 1). Мы заменили C-концевой фенилаланин в IGRP 13–25 и проксимальный серин в α цепи MHCII на цистеины (рис. 2–4). Это привело к стабильности SDS (рис. 5b) без какой-либо заметной потери эффективности связывания родственных Т-клеток, как было измерено с использованием тетрамеров pMHC и линии клеток Jurkat, трансдуцированных CD4 / TCR человека (рис.5в). Аналогичные результаты были получены с другими молекулами pHLA, такими как IGRP 23–35 / DRB1 * 0401 / DRA1 * 0101 (рис. 5b). Использование цис-ловушки также позволило получить молекулы HLA, которые гораздо труднее экспрессировать, такие как HLA-DQB1 * 0201 / DQA1 * 0501, отображающие остатки глиадина 62–72 (Таблица 1 и Рис. 5b). Cys-захват, однако, увеличивал выход продукции для некоторых, но не для всех pMHC (например, IGRP 13–25 / DRB1 * 0301 / DRA1 * 0101) (Таблица 1). Кроме того, цис-захват не может быть принят всеми pMHCII, поскольку введение искусственных цистеинов в пептид может в некоторых случаях нарушать связывание и / или активацию Т-клеток, а также потому, что эпитопы, которые уже содержат встречающиеся в природе цистеины в своей последовательности, не подходят для этот подход.

Конструкция pMHCII на основе ручки в отверстие

Для устранения этого и других ограничений текущих стратегий производства pMHCII, включая нестабильность гетеродимеров, дискретные выходы продукции и отсутствие эффективных и масштабируемых схем очистки, широко применимых к любому типу pMHC ( для использования на людях in vivo), мы исследовали возможность использования стратегии гетеродимеризации на основе «выступа в отверстие» (KIH) -IgG. Введение дополнительных аминокислотных замен в домен Ch4 области Fc человеческого IgG1 (или других подтипов IgG) приводит к образованию двух разных молекул Fc (выступ и отверстие) с благоприятной гетеродимеризацией и неблагоприятным потенциалом гомодимеризации 8,9 .Мы пришли к выводу, что, в отличие от димеризации pMHC на основе Fc-слияния, которая генерирует большие Ig-подобные молекулярные структуры, в которых образование и стабильность αβ-гетеродимера по-прежнему требуют использования лейциновых застежек и регулируются теми же принципами, которые контролируют сборку не-Fc -fused, c-jun / c-fos pMHCIIs 16,17,18,19 , основанная на KIH гетеродимеризация pMHCII потенциально может сделать pMHCII внутренне более стабильными с относительно небольшим увеличением общей молекулярной массы.

Мы связали цепь мыши IAα d с модифицированной областью Fc человеческого IgG1, чтобы вести себя как выступ (как с мотивом c-fos, так и без него), и соответствующую цепь IAβ g7 (с и без c-fos). -jun motif) к Fc-области человеческого IgG1, модифицированной так, чтобы вести себя как дыра (фиг.3а и 6а, б). В наши первоначальные разработки мы также включили сайт биотинилирования BirA, 6-кратные гистидиновые и двойные стрептококковые метки и цистеин на С-конце выступа, создавая «выступ», который больше его «дырочного» аналога. Как линии клеток с лейцином, так и без него, экспрессировали трансгенную РНК, что подтверждается экспрессией EGFP (рис. 6c, слева), но только последний секретировал G-связывающий белок в супернатанте (рис. 6c, справа). ), которая в нативном SDS-PAGE показывалась как одна полоса (рис.6d, левая панель), и как две отдельные полосы с разной молекулярной массой, как и ожидалось, но с одинаковой интенсивностью при денатурирующем SDS-PAGE (рис. 6d, правая панель), что предполагает стехиометрию ~ 1: 1. KIH-версия этого pMHCII экспрессируется в> 4 раза выше, чем его аналог, не основанный на KIH (Таблица 1). Эти молекулы складываются соответствующим образом, потому что тетрамеры pMHCII, генерируемые с помощью этих мономеров pMHCII на основе KIH, окрашивали CD4 + Т-клетки селезенки трансгенной мыши, экспрессирующей BDC2.5mi-специфический Т-клеточный рецептор (TCR), по существу, как его застегнутый на молнии, не-KIH аналог (рис.6д).

Рис. 6

Использование застежки-молнии c-jun / c-fos в pMHCII на основе KIH несовместимо с экспрессией. a , b Мультфильмы, показывающие структуру двух типов протестированных здесь конструкций KIH. c (слева). Экспрессия eGFP в клеточных линиях CHO-S, трансдуцированных лентивирусами, кодирующими конструкции, изображенные в A (вверху) и B (внизу), что указывает на адекватную транскрипцию и трансляцию конструкции. c (справа), профили FPLC элюирования pMHC класса II из колонок со стреп-тактином, загруженных супернатантами от клеток CHO, экспрессирующих конструкции в A (вверху) или B (внизу). d Влияние KIH на стабильность SDS репрезентативного гетеродимера pMHCII (из по меньшей мере 10 различных pMHC на основе KIH) в отсутствие захвата Cys. Данные соответствуют BDC2.5mi / IA g7 на базе c-jun / c-fos («conv», левая полоса) и BDC2.5mi / IA g7 на базе KIH (правая полоса). βМЕ, бета-меркаптоэтанол. e Типичные точечные диаграммы FACS тетрамер pMHCII / eGFP (TCR) для BDC2.5-TCR-трансгенных CD4 + Т-клеток, окрашенных c-jun / c-fos- ('conv', слева) или на основе KIH BDC2.5mi / IA g7 тетрамеров (справа). Показанные паттерны окрашивания являются репрезентативными, по крайней мере, для двух независимых экспериментов.

Рецепторные сигнальные свойства pMHCII на основе hIgG1 KIH

При системной доставке НЧ, покрытые рМНСII (pMHC-NP), имеющей отношение к аутоиммунным заболеваниям, могут репрограммировать (и расширять) аутоантиген. -опытные эффекторные Т-клетки / Т-клетки памяти в родственные Т-регуляторные клетки 1-го типа (TR1), приводящие к обращению вспять различных аутоиммунных заболеваний 2,5 . Биологическая эффективность этих соединений (образование клеток TR1 in vivo) является функцией валентности pMHC на поверхности NP и может быть измерена in vitro с использованием линий репортерных клеток 4 .

Мы соединили эти молекулы с НЧ, функционализированными малеимидом, через их С-концевой свободный цистеин, как описано в ссылке. 4 . Как показано на фиг. 7а, большая часть pMHC в препаратах оставалась связанной с NP при электрофорезе в SDS-PAGE в нативных условиях, но высвобождалась (в виде конъюгатов PEG-pMHC, не содержащих NP) в денатурирующих условиях. Количественная оценка валентностей pMHC этих соединений показала, что, как правило, эти мономерные структуры pMHC на основе KIH на ~ 50% больше покрывают при более низких валентностях (на ~ 20% меньше), чем их обычные аналоги, не основанные на KIH (45 ± 2.8 против 36 ± 2,5; n = 4 и 5 соответственно).

Рис. 7

Биологическая активность НЧ, демонстрирующих KIH- по сравнению с pMHCII на основе c-jun / c-fos. a Нативный (слева) и денатурирующий (справа) SDS-PAGE для НЧ, покрытых репрезентативной молекулой pMHCII на основе KIH. PFM обозначает NP оксида железа. MW: маркеры молекулярной массы; 1: 2 мкг мономеров BDC2.5mi / IA g7 на основе KIH; 2: 2,2 мкл PFM, покрытого мономерами BDC2.5mi / IA g7 на основе KIH; 3: 1,1 мкл PFM, покрытого BDC2 на основе KIH.5mi / IA g7 мономеров; 4: 2 мкг мономеров BDC2.5mi / IA g7 на основе KIH; 5: 2,2 мкл PFM, покрытого мономерами BDC2.5mi / IA g7 на основе KIH; 6: 1,1 мкл PFM, покрытого мономерами BDC2.5mi / IA g7 на основе KIH. Электрофоретическое поведение соединения pMHCII-NP на основе KIH, показанное здесь, типично для по меньшей мере 10 различных препаратов pMHCII-NP, полученных с использованием pMHCII на основе KIH. b Активность люциферазы, индуцированная НЧ, покрытыми c-jun / c-fos- («conv») или BDC2 на основе KIH.5mi / IA g7 мономеров (нормализованных к мономерам, индуцированным растворимыми анти-CD3ε mAb) на клетках Jurkat, коэкспрессирующих мышиный CD4, BDC2.5 mi / IA g7 -специфический TCR и репортер люциферазы, управляемый NFAT. Данные соответствуют среднему значению ± стандартная ошибка среднего для трех повторов. c Процент BDC2.5mi / IA g7 тетрамер-положительных CD4 + Т-клеток в крови, селезенке, лимфатических узлах поджелудочной железы (PLN), мезентериальных лимфатических узлах (MLN) и костном мозге (BM) от мышей NOD обрабатывали (два раза в неделю в течение 5 недель) НЧ, покрытые c-jun / c-fos-based ('conv') BDC2.5mi / IA g7 или на основе KIH BDC2.5mi / IA g7 мономеров (20 мкг pMHC / доза). Данные соответствуют средним значениям ± SEM для 4 мышей / группа. d Цитокиновый профиль тетрамера + клеток, выделенных из мышей в ( c ). Клетки Tetramer + заражали гранулами, покрытыми анти-CD3 / анти-CD28 mAb, в течение 3 дней и супернатанты анализировали на содержание цитокинов с использованием технологии Luminex. Данные соответствуют средним значениям ± SEM клеток, выделенных от 4 мышей / группу.Значения P были рассчитаны с помощью U Mann – Whitney и считаются значимыми, если P <0,05. e Активность люциферазы, индуцированная НЧ, покрытыми BDC2,5 mi / IA на основе KIH g7 пМНС, несущими KIH мыши или человека на основе Fc (нормализованная к активности, индуцированной растворимыми анти-CD3ε mAb) на клетках Jurkat совместно экспрессирующие CD4 мыши, BDC2.5mi / IA g7 -специфический TCR и репортер люциферазы, управляемый NFAT. Данные соответствуют среднему значению ± стандартная ошибка среднего для трех повторов. Исходные данные для панелей ( b - e ) представлены в виде файла исходных данных

. Затем мы сравнили эффективность передачи сигналов TCR NPs, покрытых не-KIH-основанным BDC2.5mi / IA g7 pMHC (при 65 pMHC / NP) с наночастицами, покрытыми его аналогом на основе KIH (при 37 pMHC / NP) (рис. 7a), на клетках Jurkat, коэкспрессирующих CD4 мыши, родственный TCR и NFAT люцифераза. Оба соединения обладали сходной эффективностью, несмотря на то, что они несли существенно разные валентности pMHC (фиг. 7b и 8a, b). Это предполагает, что эти структуры pMHC-NP на основе KIH могут оптимально работать при валентностях pMHC, падающих ниже минимальных оптимальных валентностей pMHC, определенных для обычного дизайна pMHC 4 .

Рис. 8

TCR-активность передачи сигналов pMHC-NP в зависимости от молярности pMHCII или числа NP. a , b Активность люциферазы, индуцированная НЧ, покрытыми мономерами BDC2.5mi / IA на основе c-jun / c-fos- ('conv') или KIH (нормализована к мономерам, индуцированным растворимыми анти-CD3ε). mAb) на клетках Jurkat, коэкспрессирующих CD4 мыши, BDC2.5mi / IA g7 -специфический TCR и репортер люциферазы, управляемый NFAT. Данные соответствуют основному рис. 7b, но нормированы на молярную концентрацию pMHCII или число NP. c , d Активность люциферазы, индуцированная НЧ, покрытыми BDC2.5mi / IA на основе KIH / IA g7 pMHCII, несущих KIH мыши или человека на основе Fc (нормализованная к активности, индуцированной растворимым анти-CD3ε mAb) на Jurkat клетки, коэкспрессирующие CD4 мыши, BDC2.5mi / IA g7 -специфический TCR и репортер люциферазы, управляемый NFAT. Данные соответствуют основному рис. 7e, но нормированы на молярную концентрацию pMHCII или число NP. e , f Активность люциферазы, индуцированная НЧ, покрытыми c-jun / c-fos-based («conv»), Cys-захваченными IGRP 13–25 / DR3 pMHC vs.НЧ, покрытые IGRP на основе KIH без Cys 13–25 / DR3, покрытые с тремя различными валентностями на клетках Jurkat, коэкспрессирующих человеческий CD4, IGRP 13–25 / DR3-специфический TCR и управляемый NFAT люциферазный репортер. Данные соответствуют основному рис. 9d, но нормированы на молярную концентрацию pMHCII или число NP. г , ч Активность люциферазы, индуцированная НЧ, покрытыми мономерами IGRP на основе c-jun / c-fos / Cys или KIH / Cys-ловушками 13-25 / DR3 vs.их аналоги, не захваченные Cys, на клетках Jurkat, коэкспрессирующих CD4 человека, IGRP 13–25 / DR3-специфический TCR и управляемый NFAT репортер люциферазы. Данные соответствуют основному рис. 9e, но нормированы на молярную концентрацию pMHCII или число NP. Данные соответствуют среднему значению ± стандартная ошибка среднего для трех повторов. Исходные данные представлены в виде файла исходных данных

Биологическая активность in vivo pMHCII-NP на основе hIgG1

Показав, что pMHC-NP, полученные с использованием pMHC на основе KIH, обладают адекватной TCR-связывающей и сигнальной активностью, мы попытались подтвердить что эти соединения могут также запускать образование и разрастание родственных TR1 клеток in vivo, как и в случае соединений, полученных с использованием обычных pMHC.Как показано на фиг. 7c, соединения pMHCII-NP на основе KIH запускали образование и размножение аналогичных количеств родственных (тетрамер + ) клеток TR1, как их аналоги, не основанные на KIH. Кроме того, родственные (тетрамер + ) CD4 + Т-клетки, размножающиеся in vivo в ответ на оба типа соединений, секретировали TR1-релевантные цитокины при стимуляции анти-CD3 и анти-CD28 mAb ex vivo по сравнению с их тетрамером - CD4 + Т-клеток (рис. 7г). Таким образом, эти гетеродимеры pMHC на основе KIH без застежки-молнии обладают аналогичной биологической активностью, чем обычные pMHC с застежкой-молнией.

Биологические свойства in vitro pMHCII на основе mIgG1 KIH

Потенциал гетеродимеризации структуры KIH на основе IgG1 мыши ранее не описывался. Таким образом, мы исследовали возможность создания гетеродимеров BDC2.5-I-Aβ g7 -Hole / I-Aα d -Knob, в которых knob-Fc и hole-Fc происходят из последовательности mIgG1-Fc (mKnob и mHole соответственно). Такой подход с мышиной KIH поможет снизить нежелательную иммуногенность этих соединений, используемых для экспериментов in vivo на мышах.С этой целью мы идентифицировали мышиные остатки, которые могут генерировать функциональные молекулы mKnob и mHole после модификации (рис. 2b). Образцы полос молекул очищенного белка G в денатурирующих гелях SDS-PAGE были по существу идентичны тем, которые наблюдались для их аналогов на основе hIgG1 KIH. Кроме того, наночастицы, покрытые этими молекулами, имели количественно подобные свойства передачи сигналов антиген-рецептор, как наночастицы, покрытые их аналогами на основе hIgG1 KIH (фиг. 7e и ​​8c, d).

Продукция pMHCII человека на основе hIgG1 KIH

Затем мы спросили, может ли эта стратегия KIH также использоваться для стабилизации взаимодействий более слабых пептидов: MHC, таких как IGRP 13–25 / DRB1 * 0301 / DRA1 * 0101.Как и в случае с застежкой-молнией BDC2.5-I-Aβ g7 -Hole / I-Aα d -Гетеродимеры-ручки, застегивающиеся на молнию IGRP 13–25 -DRB1 * 0301-Hole / DRA1 * 0101-Knob гетеродимеры могут не экспрессироваться, но удаление застежки-молнии c-jun / c-fos из молекулы привело к эффективной экспрессии на уровнях, значительно превышающих уровни, полученные из клеток CHO-S, секретирующих IGRP, не основанный на KIH 13–25 -DRB1 * 0301 / DRA1 * 0101 гетеродимеры (таблица 1). Тетрамеры pMHCII, полученные с помощью мономеров на основе KIH, окрашивали родственные Т-клетки, по существу, как тетрамеры, полученные с использованием мономеров pMHCII с лейциновой застежкой (рис.9а). Добавление мутаций, фиксирующих регистр цис-ловушки, в пептиде и α-цепи MHCII этих комплексов (рис. 2а и 4) дополнительно увеличивало выходы экспрессии (таблица 1). Эта молекулярная модификация не нарушала TCR-связывающие свойства этих молекул, потому что окрашивание родственных TCR-экспрессирующих клеток Jurkat тетрамером, полученным с помощью конструкций на основе CT и не-CT KIH, было по существу эквивалентным (фиг. 9b). Кроме того, эти молекулы одинаково количественно реагировали с mAb против DR (клон L243), которое связывается с конформационным эпитопом на цепи HLA-DRα, что требует правильного фолдинга гетеродимера αβ 20,21 (рис.9в).

Рис. 9

KIH Fc обеспечивает повышенную биологическую активность и стабилизирует «пустой» MHCII. a Типичные точечные диаграммы FACS тетрамера pMHCII / eGFP (TCR) для клеток Jurkat, экспрессирующих hCD4 и IGRP 13–25 / DR3-специфический TCR или mCD4 и BDC2.5mi / IA g7 -специфический TCR (отрицательный контроль ). b Репрезентативные точечные графики pMHCII тетрамер / eGFP (TCR) для клеток Jurkat в A, но окрашенных тетрамерами на основе KIH, не имеющими (слева) или несущими CT (справа). c Введение CT в pMHCII человека на основе KIH не изменяет их реактивность с MHCII конформационным эпитоп-специфическим mAb, как измерено с помощью ELISA. Данные соответствуют среднему значению ± стандартная ошибка среднего для трех повторов. d Активность люциферазы, индуцированная наночастицами, покрытыми c-jun / c-fos на основе ('conv'), CT IGRP 13–25 / DR3 pMHCs по сравнению с наночастицами, покрытыми не-CT, IGRP на основе KIH 13 –25 / DR3, покрытые с тремя различными валентностями на клетках Jurkat, коэкспрессирующих hCD4, IGRP 13–25 / DR3-специфический TCR и NFAT-люциферазу.Данные соответствуют среднему значению ± стандартная ошибка среднего для трех повторов. e Активность люциферазы, индуцированная НЧ, покрытыми мономерами на основе c-jun / c-fos / CT ('conv') или KIH / CT IGRP 13–25 / DR3 по сравнению с их не-CT-аналогами на Jurkat клетки, коэкспрессирующие hCD4, IGRP 13–25 / DR3-специфичный TCR и NFAT-люциферазу. Данные соответствуют среднему значению ± стандартная ошибка среднего для трех повторов. f SDS-PAGE мономеров CT с лейциновой молнией (1) или на основе KIH (2). Глиадин 62–72 / DQB1 * 0201 / DQA1 * 0501. βМЕ, бета-меркаптоэтанол. г Репрезентативные точечные диаграммы тетрамера pMHCII / CD4 для клеток Jurkat, экспрессирующих hCD4 и IGRP 13–25 / DR3 (вверху) или mCD4 и BDC2.5mi / IA g7 -специфический TCR (внизу), окрашенный Тетрамер на основе c-jun / c-fos ('conv') IGRP 13–25 / DR3 (связанный с пептидом; слева) или тетрамеры, полученные с использованием нагруженных пептидом пустых мономеров DR3-KIH (справа). ч Репрезентативные графики тетрамера pMHCII / eGFP (TCR) для клеток Jurkat, экспрессирующих hCD4 и PDC-E2 122–135 / DRB4-специфический TCR (вверху слева), PDC-E2 249-262 / DRB4-специфический TCR (вверху справа) или IGRP 13–25 / DR3-специфический TCR (внизу; отрицательный контроль). i Амплификация сигнала связывания тетрамера на основе KIH с использованием анти-hFc. В PBMC человека (10 6 ) добавляли клетки из hIGRP 13–25 / DR3-специфического Т-клеточного клона (вверху) или нерелевантного (PPI (76-90 (88S) / DR4-специфического) клон (10 4 ) (внизу). Клетки обрабатывали дазатинибом (справа) или оставляли необработанными (слева), а затем окрашивали PE-меченными тетрамерами и PE-меченными анти-IgG. Значения на графиках соответствуют среднему геометрическому интенсивность флуоресценции для окрашивания тетрамера pMHC.Картины окрашивания, показанные в ( a ), ( b ), ( g ) и ( h ), представляют по меньшей мере два независимых эксперимента. Исходные данные для панелей ( c - e ) представлены в виде файла исходных данных

Cys-trapping увеличивает эффективность KIH-based pMHCII

Приведенные выше данные предполагают введение цис-ловушки между IGRP 13 –25 и DR3 увеличивает структурную стабильность гетеродимера и выход продукции pMHC, не мешая связыванию TCR.Однако, когда мы сравнили in vitro эффективность НЧ, покрытых цис-захваченной версией человеческого IGRP, не основанного на KIH, 13–25 / DRB1 * 0301-DRA * 0101 pMHC (при 63 пМНС / NP) с этим наночастиц, покрытых тремя препаратами IGRP на основе KIH без цис-ловушек 13–25 / DRB1 * 0301-DRA * 0101 (46, 29 и 27 пМНС / НП), последние три вызывали значительно сниженный люциферазный ответ от родственные клетки Jurkat (рис. 8e, f и 9d). Следующие три линии доказательств предполагают возможность того, что эти различия могут быть объяснены присутствием цис-ловушки в pMHC, не основанном на KIH, который использовался в качестве контроля.Во-первых, препараты NP, демонстрирующие низкую валентность BDC2.5mi / IA g7 pMHC на основе KIH, действовали по существу так же, как NPs, демонстрируя высокую валентность своего аналога на молнии, не основанного на KIH (рис. 2b и 8a, b), что позволяет предположить, что PMHC на основе KIH поддерживают усиленную передачу сигналов TCR. Во-вторых, все три препарата NP, демонстрирующие IGRP на основе KIH без цис-ловушек 13–25 / DRB1 * 0301-DRA * 0101, также выполнялись аналогичным образом в этом анализе, независимо от валентности (от 27–46 пМНС / NP), что согласуется с гипотетической повышенной эффективностью дизайнов на основе KIH.

Чтобы исследовать эту гипотезу, мы сравнили биологическую активность НЧ, покрытых цис-захваченными и не-цис-захваченными версиями обоих типов конструкций pMHC (не на основе KIH и на основе KIH). Неожиданно для обоих типов конструкций включение цис-ловушки увеличило эффективность (фиг. 8g, h и 9e). Действительно, наночастицы, покрытые конструкцией на основе цис-ловушек на основе KIH, имели аналогичную функцию, как наночастицы, покрытые конструкцией на основе цис-ловушек, не основанной на KIH, несмотря на значительные различия в валентности pMHC (56 и 63 для цис-ловушек и не цис-ловушек). захваченные pMHC не на основе KIH, соответственно, vs.25 и 26 для pMHC на основе цис-ловушек и без цис-ловушек, соответственно), снова подтверждая идею о том, что использование pMHC на основе KIH на NP снижает порог валентности pMHC, необходимый для биологической активности.

В совокупности эти неожиданные наблюдения предполагают, что пептид-связывающая щель в некоторых мономерах pMHC, не связанных с цис-ловушками (будь то лейциновая застежка (обычная) или основанная на KIH), может быть занята эндогенными пептидами CHO-S, в отличие от связанных пептиды, кодируемые в конструкциях экспрессии.В качестве альтернативы этот подход создает более компактную структуру pMHC, которая каким-то образом усиливает взаимодействие с родственными TCR. Повышенная биологическая эффективность дизайна на основе KIH, особенно в сочетании с пептидным цис-захватом, предполагает возможность того, что половина KIH этих молекул pMHC класса II может иметь аллостерический эффект на интерфейс pMHC таким образом, чтобы улучшить взаимодействие TCR. С другой стороны, этот эффект может быть связан с особой топологией, принятой этими молекулами на основе KIH на НЧ.Радиусы pMHC на основе KIH на NP больше, чем у их аналогов с застежкой-молнией. Это может уменьшить возникновение потенциально деструктивных взаимодействий TCR-связывающего N-концевого домена pMHC с NP во время процесса функционализации. В этом отношении KIH-часть молекулы pMHC на основе KIH может буферизовать конформационные изменения в N-концевом домене pMHC, вызванные NP. Кроме того, дисульфидные связи, которые вводятся в эти KIH, могут способствовать гипотетической устойчивости этих молекул к аллостерическим изменениям, индуцированным соседними молекулами pMHC или самим NP.Каким бы ни было точное объяснение, на практическом уровне эти молекулярные модификации фактически изменяют минимальный оптимальный порог плотности pMHC для фармакодинамической активности in vivo; «32» минимальный оптимальный порог валентности pMHC, определенный для НЧ диаметром 20 нм, отображающих обычные pMHC, по-видимому, ниже для захваченных Cys pMHC на основе KIH 4 .

hIgG1 Стабилизация на основе KIH молекул пептид-HLA-DQ

Комплексы пептид-HLA-DQ сложно экспрессировать 22 .Как отмечалось выше, мы могли производить значительные количества глиадина с застежкой-молнией c-jun / c-fos 62–72 / DQB1 * 0201 / DQA1 * 0501 только тогда, когда пептид был захвачен цис на молекуле MHC, хотя и с низкими выходами. (Таблица 1 и рис. 5б). Примечательно, что замена домена лейциновой застежки на KIH позволила продуцировать глиадин 62–72 / DQB1 * 0201 / DQA1 * 0501 клетками CHO-S с выходами, которые были в 15 раз выше (таблица 1 и рис. 9f). .

Стабилизация пустых молекул MHC класса II на основе KIH

Некоторые экспериментальные подходы к картированию Т-клеточных эпитопов требуют использования обширных массивов тетрамеров pMHCII для определения реакционной способности эпитопа с помощью проточной цитометрии 23,24,25 .В этом контексте использование молекул pMHCII, отображающих ковалентно связанные пептиды, нецелесообразно, поскольку подразумевает очистку множества различных молекул pMHCII и создание соответствующих тетрамеров, меченных флуорохромом, для каждого конкретного эпитопа. Таким образом, мы исследовали, можно ли использовать подход, основанный на KIH, для экспрессии высоких уровней pMHCII, не связанных с пептидами, из клеток CHO и можно ли использовать эти соединения для загрузки пептидов in vitro. 26,27 . Как показано в таблице 1, трансдуцированные клетки CHO-S секретировали высокие уровни четырех различных непептидно-связанных типов DRB человека, включая DRB1 * 0301 / DRA1 * 0101, DRB4 * 0101 / DRA * 0101, DRB5 * 0101 / DRA * 0101. , и DRB1 * 1501 / DRA * 0101.Важно отметить, что эти комплексы могут быть загружены пептидами in vitro и соответствующими тетрамерами, связанными с родственными Т-клетками, по существу, как их связанные с пептидами аналоги (фиг. 9g, h).

Амплификация окрашивания мультимера pMHCII на основе KIH

Были описаны различные стратегии увеличения интенсивности окрашивания родственных Т-клеток с помощью мультимеров pMHC, меченных флуорохромом 28 , включая использование ингибиторов киназ, образование кооперативных pMHC / TCR кластеры со сшивающими антителами 29 , а также использование каркасов, позволяющих получать мультимерные структуры более высокого порядка, такие как декстрамеры 30 .Это особенно полезно при аутоиммунных заболеваниях, где периферические частоты аутореактивных Т-клеток и их авидность к родственным комплексам pMHC значительно ниже, чем наблюдаемые для чужеродных антиген-специфических Т-клеток, например, в контексте инфекции и аллергии. Таким образом, мы исследовали, можно ли улучшить отношение сигнал / шум при окрашивании родственных Т-клеток тетрамерами pMHCII, используя основанную на анти-hIgG амплификацию связывания тетрамера pMHCII на основе KIH. В PBMC человека добавляли клональные Т-клетки IGRP 13–25 / DR3, специфичные для CD4 + , и окрашивали родственными тетрамерами pMHCII на основе KIH в присутствии или в отсутствие ингибитора протеинкиназы дазатиниба (для ингибирования подавления TCR) с последующей амплификацией анти-hIgG-PE.Как показано на фиг. 9i, анти-hIgG увеличивал среднюю интенсивность сигнала флуоресценции при окрашивании тетрамером как в присутствии, так и в отсутствие дазатиниба.

Бразилия на грани, так как экс-президент Лула вступает в схватку с судьей Моро

SAO PAULO (Рейтер) - Когда бывший президент Бразилии Луис Инасио Лула да Силва и судья Серхио Моро впервые встречаются в зале суда в среду, контрасты - а ставки - больше некуда.

Члены Движения безземельных рабочих (MST) возле палаток в лагере поддержки перед показаниями бывшего президента Бразилии Луиса Инасио Лула да Силва федеральному судье Серхио Моро в Куритибе, Бразилия, 10 мая 2017 года.REUTERS / Nacho Doce

Один - самый популярный президент страны за всю историю и фаворит на выборах в следующем году - бывший профсоюзный лидер, который до сих пор подстегивает толпу своим пылким и народным ораторством. Другой - тихий профессор права, который представляет главное препятствие Луле к власти.

Наследие и политическое будущее первого президента Бразилии из рабочего класса находятся под угрозой, поскольку Лула сталкивается с одним из пяти уголовных дел против него, что является частью крупнейшего расследования коррупции в истории страны.

Отрицая какие-либо правонарушения, Лула и его адвокаты превратили свою защиту в нападение на самого Моро, утверждая, что опыт судьи в надзоре за расследованием взяточничества подорвал его беспристрастность. Сторонники Лулы едут из разных уголков Бразилии в город Куритиба на юге страны, чтобы протестовать перед судом.

Местные СМИ подпитали ожидания конфронтации, затаив дыхание на слушания в среду. На обложке одного из новостных журналов эти двое изображены борцами в масках, идущими лицом к лицу.С другой стороны, это боксеры, «рассчитывающие счет».

Опросник Datafolha обнаружил, что Моро был одним из немногих общественных деятелей, которые могли победить Лулу в президентской гонке 2018 года, хотя Моро отрицает, что пойдет в политику.

44-летний судья избегал обсуждать влияние своих решений на выборы и не одобрял изображения его как Давида в политическом Голиафе Лулы.

Показания Лулы - лишь еще один шаг в трехлетней операции, настаивает Моро, который в ходе расследования продолжал читать лекции студентам государственных университетов по уголовному праву.

«Меня немного беспокоит эта атмосфера конфронтации, эти завышенные ожидания относительно чего-то, что может быть совершенно банальным», - сказал судья на публичном мероприятии в понедельник по поводу слушаний на этой неделе.

Моро уже приговорил десятки бизнесменов и лиц, занимающихся отмыванием денег, за схему взяточничества с выплатой миллиардов долларов политикам в обмен на государственные контракты, политические услуги и сделки с государственными фирмами, такими как нефтяной гигант Petrobras PETR4.SA.

Должностные лица в Бразилиа должны предстать перед Верховным судом, поэтому судебное преследование предполагаемых бенефициаров в правящей партии Бразильского демократического движения и Рабочей партии, которая управляла страной при Луле и его преемнице Дилме Руссефф с 2003 по 2016 год, продвигается медленнее. .

«КЛИМАТ ПРОТИВОСТОЯНИЯ»

Прокуроры говорят, что Лула руководил этой схемой в течение восьми лет своего правления, но слушания в среду сосредоточены на том, не променял ли он свое влияние на ремонт кондоминиума на пляже.

В понедельник Моро начал заслушивать показания во втором судебном процессе против Лулы по поводу земли, купленной строительной фирмой для использования в его институте, на 12 миллионов реалов (4 миллиона долларов).

Признание виновным в любом случае, если оно будет поддержано апелляционным судом перед выборами в октябре следующего года, лишит его возможности баллотироваться на должность.

В то время как союзники Лулы призывают десятки тысяч партизан собраться в Куритибе, Моро опубликовал в Facebook видео, в котором отговаривается от конкурирующего марша сторонников расследования.

Однако даже этот призыв к сдержанности вызвал споры.

«Судья Моро, который должен быть беспристрастным, обращается напрямую к своим сторонникам. Это ненормально в демократической системе. В условиях демократии у политиков есть сторонники и противники, а не судьи », - сказал адвокат Лулы Криштиану Занин в видеоответе.

Обмен подчеркнул, что, хотя и Лула, и Моро находятся под пристальным вниманием общественности, судья может потерять больше, если допрос превратится в спорную беседу.

Ссора в зале суда вызовет жалобы сторонников Лулы, которые называют расследование политической охотой на ведьм и подкрепляют требования его адвокатов о том, чтобы дело рассматривал другой судья.

Попытки такого юридического маневра не редкость, сказал Оскар Вильена Виейра, декан юридического факультета Фонда Жетулио Варгаса.В Бразилии один и тот же судья обычно отвечает за надзор за расследованием, а затем выносит решение по делу.

Тем не менее, отношения между Моро и командой Лулы особенно напряжены на фоне их кампании по его дискредитации, которая включала жалобу юристов в ООН на то, что судья нарушил права человека Лулы во время расследования коррупции.

Моро часто ссылается на ценность общественной поддержки целевой группы, которую он курирует, указывая на уроки итальянского расследования о взяточничестве «Мани Пулите» в 1990-х годах, чтобы показать важность общественного мнения для поддержки крупного расследования коррупции.

«С политической точки зрения для судьи Моро существует больший риск», - сказал Виейра. «Его риторические возможности гораздо более ограничены. Он должен очень внимательно следить за тем, чтобы не попасться в ловушки, расставленные адвокатами Лулы ».

Отчетность Брэда Хейнса; Редакция: Брэд Брукс, Дэниел Флинн и Эндрю Хэй.

Коррекция

класса II с помощью консольного прикусного джемпера

.

С тех пор, как компания Pancherz повторно представила прибор Herbst, за прошедшие годы в его конструкцию2–4 произошло множество изменений.Согласно опросу, аппарат Herbst с коронками является функциональным аппаратом, который наиболее часто используется в США5

Одним из вариантов устройства Herbst является перемычка Cantilever Bite Jumper (CBJ; Ormco Corporation, Orange, Calif), представленная Mayes в 1994 году. CBJ предлагает множество преимуществ4,6 по сравнению с другими конструкциями Herbst. Переход от смешанного прикуса к постоянному прикусу проще. Смещение нижней оси вперед и к десне позволяет использовать более длинный стержень и трубку в сборе.Это помогает предотвратить выпадение стержня из трубки. Его намного легче содержать в чистоте, чем прибор из клееного акрила. Однако только несколько исследований7–9 показали лечебный эффект конструкции кантилевера, и эти исследования имеют некоторые недостатки. Croft et al7 включили 17 месяцев периода удержания в исследования. Burkhardt et al8 лечили только семь пациентов, для которых использовалась консольная конструкция, а VanLaecken et al9 использовали Edgewise Herbst для выравнивания зубов во время лечения.Эти исследования не были выбраны в недавнем систематическом обзоре10 о влиянии коронки или ленточного прибора Хербста.

Таким образом, целью данного исследования было оценить изменения скелета, зубочелюстной кости и мягких тканей, которые происходят во время коррекции неправильного прикуса класса II с помощью CBJ.

В проспективном клиническом исследовании приняли участие тридцать детей.Набор был проведен в ортодонтической клинике стоматологической школы Бауру Университета Сан-Паулу после клинического обследования 200 пациентов с аномалиями прикуса II класса (возрастной диапазон от 9 до 14 лет). Критерии включения включали улучшение профиля лица после того, как нижняя челюсть была сдвинута вперед, согласно Mayes.4 Во время лечения CBJ один пациент не адаптировался к устройству и прекратил лечение. Другой переехал из города, а двум другим потребовались фиксированные приспособления для выравнивания верхних резцов, и они были исключены из выборки.

Окончательная выборка состояла из 26 (15 мужчин и 11 женщин; средний начальный возраст 12,5 лет; диапазон от 9,5 до 14 лет) пациентов класса II, раздел 1, которые лечились в течение 12 месяцев с помощью CBJ. Все аппараты имели четыре коронки первых моляров с кантилевером на молярах нижней челюсти (рис. 1). На молярах верхней челюсти использовалась транспалатальная дуга, а к молярам нижней челюсти прикреплялась проволока язычной дуги, которая опиралась на поясную часть резцов нижней челюсти.Окклюзионные упоры для спицы язычной дуги не устанавливались. Строительный прикус регистрировали по расположению резцов от края до края со средним выдвижением нижней челюсти на 7,2 мм (максимум 10 мм; минимум 4 мм) за один прием. Семь пациентов получали лечение до максимального всплеска полового созревания (стадии MP3-E и MP3-F), 11,12 восемь пациентов получали лечение во время максимального всплеска полового созревания (стадии MP3-FG и MP3-G) и одиннадцать пациентов получали лечение. после максимального всплеска полового созревания (стадии MP3-H и MP3-I).Восемнадцати пациентам потребовалось расширение верхней челюсти с помощью аппарата Hyrax (Dentaurum, Pforzheim, Германия) в среднем в течение 4 месяцев. Этот прибор был удален перед размещением CBJ.

Рисунок 1.

Консольная перемычка

Рисунок 1.

Консольная перемычка

Необработанная контрольная группа с аномалиями прикуса II класса состояла из 26 субъектов (15 мужчин и 11 женщин; средний начальный возраст 9 лет.8 лет; диапазон от 9 до 11 лет) из продольных журналов того же отдела. К сожалению, более старшей контрольной группы найти не удалось. Рентгенограммы рук не были доступны для этой группы. Боковые цефалограммы для каждого субъекта измерялись на двух разных этапах: T1 = предварительная обработка; T2 = не менее 1 недели после удаления CBJ или окончания контрольного периода. Средний период наблюдения составлял 21 месяц для группы лечения и 20 месяцев для контрольной группы. Такой продолжительный период был связан с задержкой на 5 месяцев с началом лечения.

Боковые цефалограммы до и после лечения были подвергнуты стандартному цефалометрическому анализу с 35 переменными (рисунки 2–5). Основная цель этого анализа состояла в том, чтобы охарактеризовать изменения скелета, зубов и мягких тканей, которые произошли во время лечения. Кроме того, было применено подробное региональное наложение (анализ Джонстона) 13 для количественной оценки источника переднезадней коррекции соотношения моляров и избыточной струи.

Рисунок 2.

Рисунок 2.

Боковые цефалометрические записи были выполнены на ацетатной бумаге одним исследователем, а затем оцифрованы (DT-11 Digitizer; Houston Instruments, Остин, Техас). Эти данные хранились на компьютере Pentium IBM и анализировались с помощью Dentofacial Planner версии 7.02 (Dentofacial Planner Software Inc, Торонто, Онтарио, Канада), который скорректировал коэффициент увеличения изображения. Это программное обеспечение также использовалось для создания усредненных трассировок (рис. 6).

Рис. 6.

Усредненные начальные и конечные наложения составной трассировки. (A) Пациенты с CBJ. (B) Контрольные пациенты

Рис. 6.

Усредненные начальные и конечные наложения составных кривых.(A) Пациенты с CBJ. (B) Контрольные пациенты

Цефалометрические записи анализа Джонстона были сделаны вручную. Оцифровка не использовалась. Все линейные измерения были выполнены с точностью до 0,1 мм.

Средние значения и стандартные отклонения были рассчитаны для всех цефалометрических переменных. Для сравнения групп на этапе предварительной обработки использовались t -тесты.Результаты считались значимыми для P <0,05.

Поскольку в настоящем исследовании изучались люди обоих полов с широким диапазоном начального возраста, коэффициенты ожидаемой единицы роста (EGU) 14,15, полученные в результате интеграции кривых приращения роста с учетом пола16, служили ковариатами для корректировки сравнения образцы. Эти конкретные кривые были разработаны Rocky Mountain Data Systems для получения приростов роста в зависимости от возраста, пола и интервала.Для каждого года развития площади под соответствующей кривой были разделены на площадь минимального препубертатного года (среднее значение для мужчин и женщин), принятое для представления интенсивности стандартного года роста. Этот стандартный год обозначается как EGU14,15. Этот коэффициент пропорционален ожидаемой интенсивности роста - и сопутствующему изменению формы - которые, как ожидается, не получат лечения субъект того же возраста и пола в течение указанного интервала. Эти коэффициенты, суммированные за интервал лечения, представляют начальный возраст, пол и время лечения и, таким образом, будут более сильно коррелированы с несколькими показателями физического роста, чем со временем лечения.

Чтобы сравнить изменения лечения с нормальным ростом и переменными анализа Джонстона, был использован ковариационный анализ (ANCOVA), в котором EGU служила ковариатой, для оценки различий между обработанной и контрольной группами. Тесты ANCOVA для различий между средними были скорректированы, чтобы уравнять эффекты ожидаемого роста.

Группа CBJ показала большую длину верхней и нижней челюсти и значительно большее базальное переднезаднее несоответствие II класса, чем в контрольной группе в начале лечения (Wits), а также большую переднюю (N-Me) и заднюю (S-Go) высоту лица (Таблица 1).Угол между окклюзионной плоскостью и SN был больше в контрольной группе. В группе CBJ зубные ряды верхней и нижней челюсти располагались ближе к переднему краю. Группа Хербста показала большую выпуклость верхней и нижней губы и выпуклость лица.

Таблица 1.

Сравнение исходных форм ( т -тесты) a

Было отмечено значительно большее увеличение длины нижней челюсти, наряду с передней проекцией нижней челюсти, улучшением апикального базового отношения и вращением окклюзионной плоскости по часовой стрелке в группе лечения по сравнению с контрольной группой (Co-Gn, Ar-Gn, SNB, ANB, Wits и SN-окклюзионная плоскость; Таблица 2).

Таблица 2.

Сравнение изменений CBJ и контрольной группы (T1 – T2, ANCOVA) a

Воздействие лечения на резцы верхней челюсти приводило к значительному наклону неба, ретрузии, ограничению смещения вперед и большему вертикальному развитию по сравнению с контрольной группой (Таблица 2). Моляры верхней челюсти имели значительное ограничение смещения кпереди и меньшее вертикальное смещение по сравнению с контрольной группой.

Резцы нижней челюсти в экспериментальной группе показали значительный наклон губ, выпячивание и ограничение вертикального развития, а моляры нижней челюсти имели большее мезиальное смещение по сравнению с контрольной группой.

Группа CBJ показала статистически большую ретрузию верхней губы и уменьшение выпуклости лица по сравнению с контрольной группой.

Описательная статистика (средние и стандартные отклонения) для переменных анализа Джонстона показана в таблице 3 вместе с F-отношениями из ANCOVA. Линейные изменения, измеренные вдоль средней функциональной окклюзионной плоскости во время лечения, схематически изображены на вилах (рис. 7).

Рисунок 7.

Анализ вил. Сравнение консольных прыгунов (CBJ) и контрольной группы

Рис. 7.

Анализ вил. Сравнение консольных прыгунов (CBJ) и контрольной группы

Улучшение сагиттального окклюзионного отношения наблюдалось после терапии CBJ. Коррекция моляра 5,7 мм была выполнена с изменением апикального основания на 2,9 мм1.Дистальное смещение моляров верхней челюсти на 5 мм и мезиальное смещение моляров нижней челюсти на 1,1 мм.

Наклон моляров верхней челюсти был больше в группе CBJ, и эта разница (2,1 мм) была статистически значимой ( P <0,001). Наклон моляров нижней челюсти был больше в группе CBJ, и эта разница (1,1 мм) была статистически значимой ( P <0,001).

Коррекция Overjet также во многом была результатом изменений апикального основания в сочетании с 0.Дистальное смещение резцов верхней челюсти на 9 мм и мезиальное смещение резцов нижней челюсти на 1,3 мм.

Средний начальный возраст составлял 12,5 лет для группы CBJ и 9,8 года для контрольной группы, и, скорее всего, обе группы демонстрировали разную степень зрелости скелета в начале лечения. Однако EGU использовался для «тонкой настройки» групп. В качестве альтернативы мы могли бы использовать изменение в годовом исчислении (изменение за год) или даже изменение за месяц для сравнения обработок.Однако этот подход был бы не так хорош, как ANCOVA с EGU в качестве ковариаты, потому что он не корректировал бы возрастные различия в интенсивности роста.15 Задержка в начале лечения вызвала увеличение общего интервала лечения, и один необходимо учитывать это при рассмотрении результатов.

CBJ не сдерживал рост верхней челюсти. 18-летние Valant и Sinclair в исследовании Herbst с коронками из нержавеющей стали на первых молярах верхней челюсти и съемной акриловой шиной нижней челюсти обнаружили небольшое снижение SNA.Hägg et al, 19 после лечения гипсовой шиной, обнаружили, что в группе без головного убора верхняя челюсть сдвинулась вперед на 1,1 мм.

После лечения CBJ длина нижней челюсти (Co-Gn) увеличилась на 1,2 мм значительно больше, чем в контроле (Таблица 2). Наши результаты подтвердили результаты Hägg et al, 11, которые заявили, что независимо от периода роста разница в длине нижней челюсти увеличивается, когда сравнение Herbst с контрольными субъектами составляет в среднем 1.3 мм.

Значительные изменения вертикальных размеров, связанные с лечением, были отмечены только для окклюзионной плоскости SN. Средние записи наложения (рис. 6) показывают, что возможным объяснением этого изменения может быть больший наклон верхнего и нижнего моляров и интрузия верхнего моляра после обработки CBJ. Результаты анализа Джонстона подтвердили эти выводы и показали больший наклон верхней челюсти (дистальный; 2.1 мм) и нижнечелюстные (мезиальные; 1,1 мм) моляры (таблица 3). Увеличение задней высоты лица из-за вертикального роста ветви нижней челюсти не было замечено в этом исследовании, хотя это было замечено при использовании акриловых шин.3

В отличие от других исследований Herbst, 3 которые не показали значительного ретракции резца верхней челюсти, резец верхней челюсти сместился на 1,0 мм дистально в группе CBJ и на 1,3 мм вперед в контрольной группе (Таблица 2).Возможным объяснением этого эффекта может быть лучшее манжетное уплотнение после установки CBJ.

Моляры верхней челюсти были удалены на 1,4 мм в группе CBJ (Таблица 2). Pancherz и Anehus-Pancherz, 20 в исследовании, в котором использовалась бандажная конструкция с частичной и полной фиксацией, измерили дистализацию моляров верхней челюсти на уровне 2,1 мм. Windmiller21 сообщил об измерении всего 0,68 мм. Эти результаты можно объяснить различиями в конструкции приборов.

Аппарат CBJ ограничил вертикальное развитие моляров верхней челюсти. Pancherz и Anehus-Pancherz20 сообщили о интрузии моляров верхней челюсти на 0,7 мм. Lai и McNamara3 обнаружили интрузию первых моляров верхней челюсти на 1,2 мм. При сравнении CBJ с другими моделями было замечено, что он обеспечивает хороший контроль вертикального положения моляров верхней челюсти.

Значительное передвижение резцов нижней челюсти было отмечено в группе CBJ (L1-PogPerp = 1.46 мм; IMPA = 6,6 градуса). Также было замечено, что язычная дуга без окклюзионных опор не могла выдерживать силы наклона, воздействующие на коренные зубы нижней челюсти кантилеверами. Во многих случаях язычная дуга соскальзывала с поясной части резцов нижней челюсти и касалась десны позади них. В этих случаях язычная дуга образовывала язвы в десне и способствовала проклинированию резцов нижней челюсти (рис. 8). Однако CBJ не заставлял резцы нижней челюсти выступать так сильно, как при других конструкциях 9,19,22 аппарата Herbst.

Рис. 8.

Эффект кантилевера прикусной перемычки (CBJ) с язычной дугой без окклюзионных упоров на нижние резцы. (А) До лечения. (B) Изготовление язычной дуги. (C) После лечения CBJ

Рис. 8.

Эффект Cantilever Bite Jumper (CBJ) с язычной дугой без окклюзионных упоров на нижние резцы. (А) До лечения. (B) Изготовление язычной дуги.(C) После лечения CBJ

Лечение

CBJ продвинуло первые моляры нижней челюсти вперед (на 1,3 мм), чем при использовании только фиксации премоляров (1,0 мм) 22; меньшее смещение вперед наблюдалось при фиксации литой шины (2,5 мм) 22, акриловой шине (1,7 мм), 21 и Cantilever Herbst без язычной дуги (3,8 мм) 9

В группе CBJ моляры нижней челюсти показали почти одинаковое вертикальное развитие в обработанной и контрольной группах.По сравнению с другими конструкциями 3 CBJ продемонстрировал хороший контроль вертикального положения моляров нижней челюсти.

Измерения профиля показали, что лечение CBJ оказало хорошее влияние на профиль лица. Это исследование подтверждает выводы Pancherz и Anehus-Pancherz, 23 которые сообщили о снижении выпуклости профиля мягких тканей лица. Кроме того, верхняя губа стала ретрузией, а нижняя в среднем осталась неизменной по сравнению с линией E.23

Средняя коррекция моляров II класса на 5,7 мм и коррекция избыточной струи 5,3 мм были достигнуты во время терапии CBJ (Таблица 3 и Рисунок 7). Аналогичные коррекции моляров и избыточной струи были зарегистрированы для других образцов Herbst. Pancherz и Hansen24 сообщили о среднем значении коррекции моляра 6,3 мм и коррекции сверхоструйной печати 6,9 мм. Valant и Sinclair18 описали коррекцию моляра 7,1 мм; Lai и McNamara3 достигли средней коррекции моляров 5.7 мм и коррекция оверджета 4,5 мм.

Когда вклад зубных и скелетных изменений сравнивался с 5,7-миллиметровой коррекцией моляров, наблюдаемой в группе CBJ, было отмечено, что зубные изменения составляли 48,2%, а изменения скелета составляли 50,8% коррекции моляров. Valant и Sinclair18 в своем исследовании обнаружили, что изменение апикального основания составляет 56,5% коррекции моляра, тогда как Lai и McNamara3 обнаружили, что рост составляет 55% коррекции моляра.Эти результаты были больше, чем определение Pancherz и Hansen24, которое составило 35% для ленточного лечения Хербста. Средняя продолжительность лечения составляла 6 месяцев, как сообщили Pancherz и Hansen24, 10 месяцев в исследовании Valant и Sinclair, 18 и 12 месяцев в исследовании Lai и McNamara3 и в настоящем исследовании. Эти различия во времени лечения и дизайне анкеровки могут объяснить наблюдение, что изменения скелета в меньшей степени способствовали коррекции класса II в исследовании Herbst с полосами.

В группе CBJ на перемещение зубов приходилось 45 человек.3% коррекции переброса. Мы можем заключить, что изменение апикального основания было ответственным за 54,7% коррекции оверджета в группе CBJ.

По сравнению с акриловой шиной Herbst, CJB продемонстрировал хороший контроль вертикального размера без недостатка громоздкой съемной акриловой шины.

CBJ не следует рекомендовать очень маленьким детям.Стержни и трубки очень громоздкие. Такой размер придает прочности и делает прибор практически неразрушимым, но к нему сложно привыкнуть. При использовании этого устройства важно использовать нижнечелюстную лингвальную дугу с окклюзионными упорами на премолярах или молочных молярах, чтобы предотвратить наклон кантилевера и наклон резца нижней челюсти. Использование окклюзионных опор без язычной дуги не предотвращает потерю фиксации нижней челюсти.

Стандартные ремешки, используемые с аппаратом Herbst, должны быть усилены припоем, дополнительным материалом ремешка или окклюзионной опорной проволокой, припаянной вокруг них для устойчивости.Даже с этими модификациями ленточные приборы Herbst имеют больший процент поломок. Некоторые производители разработали более тяжелые ремешки, но они не так устойчивы, как коронки из нержавеющей стали. Однако коронки с зубов удалить намного сложнее. Основным клиническим преимуществом CBJ является тот факт, что он поставляется с предварительно установленными осями, и его использование может сократить лабораторное время.

границ | Оптимизированный протокол для обнаружения многофункциональных эпитоп-специфичных CD4 + Т-клеток, сочетающих тетрамер MHC-II и технологии окрашивания внутриклеточных цитокинов

Введение

Изучение активации Т-клеток CD4 + и эффекторной функции является фундаментальным для характеристики иммунных ответов на вакцинацию (1).

CD4 + Т-клетки играют центральную роль в опосредовании иммунных ответов на вакцины, формируя как гуморальный, так и клеточный иммунитет (2). Активированные CD4 + Т-клетки критически участвуют в предоставлении родственной помощи В-клеткам для выработки защитных антител и модуляции функций макрофагов и цитотоксических Т-клеток CD8 + посредством секреции цитокинов. Таким образом, характеристика выработки цитокинов антиген-специфическими Т-клетками имеет решающее значение для профилирования иммунных ответов на вакцины.Прямой и специфический метод идентификации антиген-специфических CD4 + Т-клеток основан на методе окрашивания тетрамера главного комплекса гистосовместимости (MHC) (3). Эта процедура позволяет идентифицировать специфические Т-клетки благодаря селективному и поливалентному связыванию тетрамерных MHC-пептидных комплексов с Т-клеточными рецепторами (TCR) (3, 4) и используется для характеристики первичных и повторных антиген-специфичных CD4. + Т-клеточные ответы во многих доклинических исследованиях и исследованиях на людях (1, 5–9).

Эффекторная функция реактивированных антигеном Т-клеток обычно измеряется с помощью окрашивания внутриклеточных цитокинов (ICS) на основе проточной цитометрии, что позволяет одновременно охарактеризовать фенотип и выявить цитокины в отдельных клетках (10, 11). Характеристика внутриклеточных цитокинов позволяет идентифицировать активированные CD4 + Т-клетки, способные продуцировать более одного цитокина, и анализ этих многофункциональных / полифункциональных клеток важен для характеристики иммунного ответа, вызванного вакцинацией или естественной инфекцией (12).Полифункциональные CD4 + Т-клетки, секретирующие интерферон (IFN) -γ, фактор некроза опухоли (TNF) -α и интерлейкин (IL) -2, были предложены в качестве основного компонента иммунного ответа, который коррелирует с защитой мышей от заражения. Leishmania major (13). При туберкулезе (ТБ) не выяснено, коррелируют ли частота и качество полифункциональных Т-клеточных ответов CD4 + у мышей с помощью различных типов вакцин с защитным иммунитетом (14-17), в то время как исследования на людях показали, что последовательный ответ CD4 + Т-клеток, коэкспрессирующих IFN-γ, TNF-α и IL-2, был связан с острой инфекцией ТБ (18).Мечение тетрамеров и окрашивание внутриклеточных цитокинов, как правило, не рекомендуется проводить одновременно, поскольку рестимуляция in vitro антигена может вызвать интернализацию TCR, тем самым теряя возможность обнаружения эпитоп-специфических CD4 + Т-клеток с использованием тетрамеров (19).

Чтобы определить протокол для определения продукции внутриклеточных цитокинов в активированных эпитоп-специфических CD4 + Т-клетках, мы оценили различные стратегии, которые сочетали клеточную рестимуляцию (с вакцинным антигеном или тетрамерами) и окрашивание тетрамера (внеклеточное или внутриклеточное) с мечение внутриклеточных цитокинов.Различные процедуры были протестированы на двух разных моделях. В первом случае мышей иммунизировали химерным противотуберкулезным вакцинным антигеном H56 (20), смешанным с адъювантом CAF01 (21), модельным вакцинным составом, глубоко охарактеризованным в доклинических исследованиях своей способностью вызывать как гуморальный, так и клеточный ответ (9, 22–24). H56 представляет собой слитый белок Mycobacterium tuberculosis, антигенов Ag85B, ESAT-6 и Rv2660, и H56-специфический CD4 + Т-клеточный ответ можно контролировать с помощью Ag85B 280-294 -комплексных тетрамеров MHC класса II. (8).Во втором эксперименте мышей иммунизировали модельным куриным овальбуминовым антигеном и оценивали Т-клеточный ответ CD4 + с использованием тетрамеров, специфичных для эпитопа 325-335 (25).

Сравнительный анализ различных протоколов позволил оптимизировать процедуру идентификации многофункционального профиля тетрамер-специфичных CD4 + Т-клеток путем проведения внутриклеточного окрашивания как тетрамерами, так и цитокин-специфическими антителами при рестимуляции антигена.Этот метод представляет собой полезный инструмент для идентификации эпитоп-специфичных Т-клеток CD4 + и анализа их специфической эффекторной функции.

Материалы и методы

Мыши

Самок мышей C57BL / 6, приобретенных у Charles River (Лекко, Италия), содержали в специальных условиях, свободных от патогенов, в помещении для животных Лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии (LA.MMB), Департамент медицинских биотехнологий Университета г. Сиена, и лечится в соответствии с национальными стандартами (Decreto Legislativo 26/2014).Протокол был одобрен Министерством здравоохранения Италии (разрешение № 1004/2015-PR, 22 сентября 2015 г.).

Иммунизация

Группы из 10–12 мышей иммунизировали подкожным путем в основании хвоста химерным противотуберкулезным вакцинным антигеном H56 (2 мкг / мышь) в сочетании с адъювантом CAF01 (250 мкг диметилдиоктадециламмония и 50 мкг дибегената трегалозы / мышь). и усилен более низкой дозой одного H56 (0,5 мкг / мышь) через 4 недели. H56 и CAF01 были любезно предоставлены Statens Serum Institut, Дания.Другая группа из 6 мышей иммунизирована альбумином из белка куриного яйца (OVA, 25 мкг / мышь, Sigma-Aldrich) в сочетании с адъювантом CAF01 и усилена только OVA. Прайминговые составы, содержащие антигены и CAF01, вводили в объеме 150 мкл / мышь Tris 10 мМ, тогда как бустерные составы, содержащие только H56 и OVA, в объеме 100 мкл / мышь 1X физиологического раствора с фосфатным буфером Дульбекко (1X PBS). Мышей умерщвляли через 5 дней после иммунизации.

Сбор образцов и подготовка клеток

Селезенки, взятые у мышей, растирали на нейлоновых ситах 70 мкм (Sefar Italia, Италия) и промывали полной средой RPMI (cRPMI) [RPMI (Lonza, Бельгия), 100 ед. / Мл пенициллина / стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки ( Gibco, США)] в течение 10 мин при 300 г и 4 ° С.Спленоциты обрабатывали буфером для лизиса эритроцитов (1x, eBioscience, США) в течение 4 мин. После центрифугирования при 300 × g при 4 ° C в течение 10 мин клетки промывали 1X PBS и подсчитывали с помощью счетчика клеток (Bio-Rad, США).

Протоколы и реагенты

Были оценены шесть различных протоколов для обнаружения внутриклеточных цитокинов в активированных эпитоп-специфических CD4 + T-спленоцитах, которые по-разному сочетали рестимуляцию клеток, окрашивание тетрамерами и мечение цитокинов (рис. 1).Протоколы были протестированы в двух различных экспериментальных условиях, в которых мышей иммунизировали антигенами H56 или OVA, а Т-клеточный ответ CD4 анализировали с использованием двух разных тетрамеров, специфичных для эпитопов H56 и OVA, соответственно.

Рисунок 1 . Дизайн исследования. Шесть различных протоколов, сочетающих стимуляцию антигеном и окрашивание тетрамера с внутриклеточной маркировкой цитокинов, были использованы для обнаружения антиген-специфичных CD4 + Т-клеток, продуцирующих цитокины, в спленоцитах мышей, иммунизированных двумя разными антигенами, H56 или OVA, и адъювантом CAF01, 5 дней. после бустерной иммунизации.В протоколах 1–3 спленоциты рестимулировали соответствующим антигеном (Ag, розовый прямоугольник), добавленным до (протоколы 1 и 2) или после (протокол 3) окрашивания тетрамера (зеленый прямоугольник), тогда как в протоколах 4–6 стадию рестимуляции проводили непосредственно с Ag85B или тетрамерами MHC II, связанными с эпитопом OVA. Анти-CD28 и анти-CD49d (костимулы) добавляли с Ag (протоколы 1–3) или тетрамерами (протоколы 4–6). После инкубации с Ag или тетрамером клетки обрабатывали брефельдином А и монензином в течение 4–5 часов при 37 ° C, фиксировали и пермеабилизировали (серый прямоугольник) и, наконец, окрашивали антицитокиновыми антителами (темно-серый прямоугольник), за исключением протокола 1. , в котором окрашивание тетрамера проводили в фиксированных и проницаемых клетках вместе с окрашиванием цитокинов.В протоколе 6 окрашивание тетрамера проводили в течение 2 ч при 37 ° C.

Протокол 1

спленоцитов (2 × 10 6 / лунку) культивировали в круглодонном 96-луночном планшете с белком H56 (2 мкг / мл) или OVA (50 мкг / мл), костимулами анти-CD28 и анти-CD49d ( 2 мкг / мл, eBioscience) при 37 ° C, 5% CO 2 в течение 6 часов, с брефельдином A (BFA, 5 мкг / мл, Sigma-Aldrich) и раствором монензина (1 ×, eBioscience), добавленным во время последние 5 ч инкубации. После центрифугирования при 300 g при 4 ° C в течение 7 минут клетки метили Fixable Viability Stain 780 (FVS780, BD Biosciences, 1: 1000, 100 мкл / лунку) в течение 20 минут при комнатной температуре (RT) в темноте. и дважды промывали PBS.Клетки фиксировали и пермеабилизировали в течение 20 мин при 4 ° C с помощью BD Cytofix / Cytoperm (BD Biosciences). Образцы блокировали в течение 30 мин при 4 ° C в Fc-блокирующем растворе (5 мкг / мл мАт CD16 / CD32, eBioscience, США) и окрашивали в течение 1 ч при комнатной температуре с помощью PE-конъюгированного IA (b) M. tuberculosis Тетрамер предшественника Ag85B 280-294 (FQDAYNAAGGHNAVF) (разведенный 1:80, далее Tet-Ag85B) или тетрамер яйцеклетки цыпленка 325–335 (QAVHAAHAEIN), конъюгированный с PE, оба тетрамера (разбавленный 1:50, далее Tet-OVA); тетрамеры были любезно предоставлены NIH MHC Tetramer Core Facility, Университет Эмори, Атланта, Джорджия, США), разведенные в перманентном / промывном буфере.В последние 20 мин инкубации тетрамера была добавлена ​​следующая смесь флуоресцентных антител: АРС-конъюгированные анти-CD3 (клон 145-2C11), конъюгированные с BB700 анти-CD4 (клон RM-5), конъюгированные с APC-R700, анти-CD44 (клон IM-7), BV786-конъюгированный анти-IFN-γ (клон XMG1.2), BV650-конъюгированный анти-TNF-α (клон MP6-XT22), BV421-конъюгированный анти-IL-17A (клон TC11-18h20), анти-IL-2, конъюгированный с PE-CF594 (клон JES6-5h5) (все антитела были приобретены у BD Biosciences). Все антитела и тетрамеры титровали до оптимального разведения.

Протокол 2

спленоцитов культивировали с соответствующими антигенами и костимулами, как в протоколе 1, а затем промывали и окрашивали соответствующими тетрамерами в течение 1 ч при комнатной температуре. Клетки метили FVS780, фиксировали и пермеабилизировали BD Cytofix / Cytoperm и окрашивали смесью флуоресцентных антител в течение 20 мин при комнатной температуре.

Протокол 3

Спленоциты окрашивали соответствующими тетрамерами в течение 1 часа при комнатной температуре, промывали и стимулировали соответствующими антигенами и костимулами анти-CD28 и анти-CD49d при 37 ° C в течение 6 часов, с добавлением BFA и раствора монензина в течение последних 5 часов. инкубации.Клетки метили FVS780, фиксировали и пермеабилизировали BD Cytofix / Cytoperm и окрашивали смесью флуоресцентных антител в течение 20 мин при комнатной температуре.

Протокол 4

Спленоциты культивировали с соответствующими тетрамерами и костимулами в течение 1 часа при комнатной температуре, промывали и добавляли BFA и раствор монензина при 37 ° C в течение 5 часов. Клетки метили FVS780, фиксировали и пермеабилизировали BD Cytofix / Cytoperm и окрашивали смесью флуоресцентных антител в течение 20 мин при комнатной температуре.

Протокол 5

спленоцитов культивировали с соответствующими тетрамерами и костимулами в течение 1 ч при комнатной температуре и в течение 5 ч при 37 ° C в присутствии BFA и монензина.Клетки метили FVS780, фиксировали и пермеабилизировали BD Cytofix / Cytoperm и окрашивали смесью флуоресцентных антител в течение 20 мин при комнатной температуре.

Протокол 6

спленоцитов культивировали с соответствующими тетрамерами и костимулами в течение 6 часов при 37 ° C, с BFA и монензином в течение последних 4 часов инкубации. Клетки метили FVS780, фиксировали и пермеабилизировали BD Cytofix / Cytoperm и окрашивали смесью флуоресцентных антител в течение 20 мин при комнатной температуре.

Проточная цитометрия

Примерно 7 × 10 5 окрашенных клеток из каждого протокола были получены на проточном цитометре BD LSRFortessa ™ X20 (BD Biosciences) и сохранены.Анализ данных выполняли с использованием FlowJo v10 (TreeStar, США), а оценку коэкспрессии различных цитокинов выполняли с использованием платформы FlowJo Boolean gate. Контроли флуоресценции минус один (FMO) выполняли для всей флуоресценции и использовали для настройки стробирования.

Статистический анализ

Для оценки статистической разницы между протоколами использовался тест

Краскела-Уоллиса, за которым следовал пост-тест Данна для множественных сравнений. Значение P ≤ 0,05 считалось значимым.Анализы выполняли с помощью GraphPad Prism v7 (GraphPad Software, США).

Результаты

Чтобы оптимизировать протокол обнаружения внутриклеточных цитокинов в активированных эпитоп-специфических CD4 + Т-клетках, мы протестировали различные процедуры на спленоцитах мышей, парентерально иммунизированных двумя разными антигенами, химерным противотуберкулезным вакцинным антигеном H56 или OVA в сочетании с липосомный адъювант CAF01 через 5 дней после бустерной иммунизации. Индукцию Ag-специфичных CD4 + Т-клеток, продуцирующих цитокины, оценивали, сочетая рестимуляцию антигена и окрашивание тетрамером с последующим обнаружением внутриклеточных цитокинов (рис. 1).В протоколах 1–3 спленоциты рестимулировали соответствующими антигенами, добавленными до (протоколы 1 и 2) или после (протокол 3) окрашивания тетрамера. В протоколах 4–6 этап рестимуляции выполнялся непосредственно с комплексными с эпитопом тетрамером MHC II, которые поэтому использовались не только как инструмент окрашивания, но и как функциональный стимул. Сравнение результатов, полученных при использовании различных стратегий и протестированных с двумя разными антигенами, позволило оптимизировать процедуру идентификации цитокинового профиля тетрамер-специфичных CD4 + Т-клеток.

Идентификация тетрамер-специфичных CD4

+ Т-клеток, продуцирующих цитокины

H56-специфичных CD4 + Т-клеток были идентифицированы с использованием комплексных тетрамеров MHC класса II Ag85B 280-294 , специфичных к иммунодоминантному эпитопу Ag85B (26), который является частью химерного белка H56, в то время как OVA-специфичный CD4 + Т-клетки были идентифицированы с использованием тетрамеров MHC класса II в комплексе с OVA 325-335 цыпленка. Тетрамер-положительные клетки (Tet-Ag85B + или Tet-OVA + ) были идентифицированы как живые одиночные CD3 + CD4 + CD44 + клетки.Все ворота были определены на основе соответствующих контролей предприятия. Специфичность окрашивания определяли с использованием контрольного тетрамера в комплексе с неродственным антигеном, который показал уровень окрашивания ниже 0,02% (данные не показаны). Идентификация клеток Tet-Ag85B + в различных шести протоколах и их внутриклеточная продукция TNF-α, IFN-γ, IL-17 и IL-2 показаны на фиг. 2A, B соответственно.

Рисунок 2 . Проточно-цитометрический анализ Tet-Ag85B + Т-клеток, продуцирующих цитокины. (A) Ag85B-тетрамерсвязывающие Т-клетки были идентифицированы среди живых одиночных CD3 + CD4 + как CD44 high Tet-Ag85B + клеток в шести различных протоколах, и сообщается частота положительных клеток. внутри точечных графиков. (B) Внутриклеточная продукция цитокинов TNF-α, IFN-γ, IL-17 и IL-2, оцениваемая в Т-клетках Tet-Ag85B + в шести различных протоколах. Частоты положительных клеток указаны на точечных графиках.Гейты определяли для соответствующих контрольных значений флуоресценции минус один (FMO).

Протокол

ICS обычно включает этап стимуляции антигена, который имеет решающее значение для активации эффекторной функции CD4 + Т-клеток. Тем не менее, этот этап вызывает интернализацию молекул TCR, тем самым отрицательно влияя на процедуру окрашивания тетрамера. Чтобы преодолеть это ограничение, мы оценили стратегию, основанную на фазе стимуляции антигена с последующей пермеабилизацией и фиксацией клеток и последующим окрашиванием тетрамерами (рис. 1, протокол 1).Используя эту процедуру, которая позволяет идентифицировать как внеклеточные, так и внутриклеточные молекулы TCR, мы обнаружили 0,53% клеток Tet-Ag85B + (рис. 3A, оранжевая рамка). Эта частота была значительно выше по сравнению с протоколом 2, в котором спленоциты сначала стимулировали антигеном H56, а затем метили конкретным тетрамером (рис. 1, протокол 2), что позволило идентифицировать только 0,2% тетрамер-положительных Т-клеток (рис. 3A, светло-зеленый).

Рисунок 3 .Идентификация тетрамер-специфичных CD4 + Т-клеток и их цитокиновая продукция. Тетрамер-специфические CD4 + Т-клетки и их выработку цитокинов оценивали в спленоцитах, обработанных с помощью различных протоколов, представленных на рисунке 1. (A, B) Ящичковые диаграммы частот Tet-Ag85B + (A) и Tet-OVA + (B) Т-клеток относительно CD4 + Т-клеток, обнаруженных с использованием протоколов 1–6, как показано на оси x.Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего для 10–12 мышей, полученных в трех независимых экспериментах. Для оценки статистической разницы между протоколами использовался тест Краскела-Уоллиса, за которым последовал пост-тест Данна для множественных сравнений (* P ≤ 0,05, *** P ≤ 0,001). (C, D) Частоты TNF-α-, IFN-γ-, IL-17- и IL-2-положительных клеток среди Tet-Ag85B + (C) и Tet-OVA + (D) клеток, используя протоколы 1–6, как указано на оси x.Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего для 10–12 мышей, полученных в трех независимых экспериментах. Значительное различие между каждым цитокином среди различных протоколов согласно тесту Краскела-Уоллиса, за которым следует посттест Данна для множественных сравнений ( P ≤ 0,05), указано буквами над полосами ошибок; «А» - существенная разница по сравнению с протоколами 4, 5 и 6; «Б» по сравнению с протоколом 5; «C» по сравнению с протоколами 4 и 5; «D» по сравнению с протоколами 3, 5 и 6; «E» по сравнению с протоколом 4.

Также оценивалось влияние окрашивания тетрамером перед рестимуляцией антигеном (рис. 1, протокол 3).Эта процедура позволила обнаружить 0,37% Т-клеток Tet-Ag85B + , что было выше по сравнению с протоколом 2, но было ниже по сравнению с протоколом 1 (рис. 3A, темно-зеленая рамка). Более высокое количество Т-клеток Tet-Ag85B + , обнаруженное в протоколе 1, может быть связано с эффектом предшествующей рестимуляции антигена, которая, как известно, индуцирует образование больших кластеров молекул TCR, тем самым увеличивая авидность связывания тетрамера (27).

В протоколах 4, 5 и 6 не было стимуляции антигеном, и тетрамеры MHC класса II в комплексе с Ag85B 280-294 использовали не только для идентификации, но и для стимуляции антиген-специфических CD4 + Т-клеток ( Рисунок 1, протоколы 4, 5 и 6).Как и ожидалось, частоты Tet-Ag85B + Т-клеток, обнаруженные в протоколе 4, были сопоставимы с таковыми из протокола 3 (рис. 3A, светло-синий и темно-зеленый прямоугольники). В протоколах 5 и 6, в которых фаза инкубации тетрамера в течение 6 часов проводилась без стимуляции антигеном, наблюдались значительно более высокие частоты 1,07 и 1% Т-клеток Tet-Ag85B + по сравнению с образцами, стимулированными H56 (рис. 3A. , P ≤ 0,05 и P ≤ 0,001 по сравнению с протоколами 3 и 2 соответственно).Аналогичное поведение наблюдалось у мышей, иммунизированных антигеном OVA, у которых OVA-специфические CD4 + Т-клетки были идентифицированы с использованием тетрамера OVA 325-335 в комплексе с пептидом (рис. 3В). Это показывает, что тетрамеры с разной пептидной специфичностью очень сходным образом реагируют на процедуры окрашивания in vitro , оцениваемые в различных протоколах.

Эффекторная функция Tet-Ag85B + и Tet-OVA + Т-клеток, идентифицированных с помощью различных стратегий, была проанализирована путем измерения внутриклеточной продукции четырех различных цитокинов с использованием многопараметрической проточной цитометрии.Как показано на рисунках 3C, D, самый высокий процент клеток, продуцирующих внутриклеточные цитокины, был обнаружен для обоих тетрамеров в протоколах 1 и 2, а также для Tet-Ag85B + в протоколе 3 по сравнению с протоколами 4, 5 и 6. Эти данные показывают, что в отсутствие стимуляции антигеном, несмотря на высокую частоту тетрамерсвязывающих Т-клеток CD4 + (протоколы 5 и 6, фиг. 3A, B), индуцируется значительно более низкая продукция цитокинов (фиг. 3C, D), что подчеркивает важность этапа рестимуляции in vitro вакцинным антигеном для эффективной стимуляции эффекторной функции антигенспецифических Т-клеток CD4 + .

Оценка тетрамер-специфичного CD4

+ многофункционального профиля Т-клеток

Чтобы получить картину многофункциональных профилей Т-клеток, вызванных иммунизацией и обнаруженных с помощью различных экспериментальных процедур, был проведен логический анализ данных в клетках Tet-Ag85B + (рис. 4A). Значительное количество клеток, положительных по всем четырем цитокинам или по TNF-α, IFN-γ и IL-2, наблюдалось в протоколах 1 и 3 по сравнению с протоколами 4 и 5 ( P ≤ 0.05). Количество клеток, продуцирующих только IFN-γ, было значительно выше в протоколах 5 и 6 по сравнению с протоколом 2 ( P ≤ 0,01). Анализ частоты клеток, вырабатывающих два или более цитокинов (многофункциональные), один (один) или отсутствие цитокинов в каждом протоколе, показывает, что частота многофункциональных Tet-Ag85B + Т-клеток была выше в протоколах 1, 2. , и 3 (79, 68, 69% соответственно), которые включали рестимуляцию антигена. Более низкие частоты многофункциональных клеток наблюдались в протоколах 4, 5 и 6 (12, 7, 18% соответственно), в которых большинство клеток не производили цитокинов (75, 74, 68%) (Рисунок 4B).Внутриклеточное окрашивание тетрамером, выполненное в протоколе 1, позволило выявить самый высокий процент многофункциональности, в то время как никаких различий между протоколами 2 и 3 не наблюдалось. Таким образом, оптимальная стратегия окрашивания, которая позволяет идентифицировать многофункциональные Т-хелперные клетки среди тетраммеров. специфические CD4 + Т-клеток был протоколом 1.

Рисунок 4 . Многофункциональный ответ Т-клеток Tet-Ag85B + . Многофункциональные профили Т-клеток Tet-Ag85B + были обнаружены с помощью различных экспериментальных процедур. (A) Гистограммы представляют количество Tet-Ag85B + Т-клеток, продуцирующих различные комбинации цитокинов, показанных на оси x, обнаруженных с использованием различных протоколов. Ответы сгруппированы и имеют цветовую кодировку в соответствии с функциональностью (оранжевый для одного цитокина, голубой для двух или более цитокинов). Значения представлены как среднее ± SEM для 10–12 мышей, полученные в трех независимых экспериментах, а числа над полосами ошибок указывают, какие протоколы значительно различаются в соответствии с тестом Краскела-Уоллиса, за которым следует посттест Данна для множественных сравнений ( P ≤ 0.05). (B) Круговые диаграммы шести протоколов, в которых каждый кусочек круговой диаграммы представляет собой фракцию Tet-Ag85B + Т-клеток, продуцирующих два или более цитокинов (несколько цитокинов, светло-синий), один (оранжевый) , или нет (серый). Частоты сообщаются в каждом срезе.

В заключение, наш сравнительный анализ, проведенный с двумя разными антигенами и их соответствующими тетрамерами, показал, что оптимальной стратегией для определения многофункционального цитокинового профиля тетрамер-специфичных CD4 + Т-клеток является процедура 1, в которой рестимуляция антигена За фазой следует окрашивание внутриклеточного тетрамера.Действительно, этот протокол позволяет обнаруживать значительное количество тетрамер-специфичных Т-клеток и их многофункциональную активность, а также позволяет сократить время окрашивания путем добавления цитокин-специфических антител в последние 20 минут инкубации тетрамера. Полное описание протокола 1 приведено на рисунке 5.

Рисунок 5 . Оптимальная процедура идентификации многофункциональных тетрамер-специфичных CD4 + Т-клеток. Схематическое изображение протокола, оптимизированного для обнаружения многофункциональных эпитоп-специфичных CD4 + Т-клеток.Спленоциты культивируют в 96-луночных планшетах с антигеном и костимулами в течение 1 ч при 37 ° C, чтобы обеспечить презентацию антигена APC для родственных эпитоп-специфических CD4 + Т-клеток. Стимуляция антигеном вызывает реактивацию эффекторной функции клеток CD4 + и интернализацию TCR. Брефельдин A (BFA) и раствор монензина добавляют в течение последних 5 часов инкубации для блокирования секреции цитокинов. Клетки фиксируют и стабилизируют в течение 20 минут при 4 ° C, а затем одновременно окрашивают тетрамером MHC II (1 час при комнатной температуре) и поверхностными маркерами / цитокин-специфическими антителами (последние 20 минут).Это позволяет обнаруживать как экспрессируемые на поверхности, так и интернализованные молекулы TCR с помощью внутриклеточных цитокинов. Одношаговая процедура окрашивания позволяет сократить сложное время протокола. Затем окрашенные образцы анализируют методом проточной цитометрии.

Обсуждение

В этом исследовании мы оптимизировали протокол проточной цитометрии для идентификации на уровне отдельных клеток многофункциональных эпитоп-специфичных CD4 + Т-клеток, вызванных иммунизацией. Продемонстрировав плюсы и минусы различных протоколов, мы показали, что оптимальная процедура для одновременного обнаружения эпитоп-специфичных Т-клеток CD4 + и их эффекторной функции основана на антигенной стимуляции клеток в сочетании с однократным окрашиванием цитокинов и тетрамеров. в проницаемых клетках (рис. 5).Наш анализ был основан на сравнении различных экспериментальных процедур, протестированных с двумя разными эпитоп-специфическими тетрамерами, в которых по-разному сочетались этапы рестимуляции антигена, окрашивания тетрамера и цитокина. Систематический анализ различных процедур, выполняемых на одних и тех же образцах, дал возможность выбора оптимального протокола среди различных стратегий. Результаты были подтверждены с использованием тетрамеров, специфичных для двух разных антигенов, что усиливает возможности применения выбранной процедуры для характеристики сложного функционального профиля CD4 + Т-клеточных ответов при вакцинации или инфекции.

Большинство исследований продукции внутриклеточных цитокинов в тетрамер-положительных клетках было проведено на Т-клетках CD8 + (28–30), в то время как небольшое количество работ было выполнено на Т-клетках CD4 + с тетрамерами МНС класса II (31 –33), и ни один из них не сравнивал различные протоколы систематическим образом. Как правило, мы можем наблюдать, что в этих исследованиях окрашивание тетрамера выполнялось внеклеточно, часто перед этапом стимуляции антигеном, даже несмотря на то, что прямое сравнение с настоящим исследованием затруднено из-за различных экспериментальных условий, то есть использования Т-клеток. клоны или человеческие CD4 + Т-клетки, длительная инкубация с антигеном для активации клеток и обогащение тетрамер-положительных клеток магнитными шариками перед окрашиванием ICS.Наш анализ ясно показывает, что антигенная стимуляция необходима для эффективной реактивации эффекторной функции клетки, и такой же эффект стимуляции не может быть получен при прямой инкубации клеток с тетрамерами MHC в комплексе с эпитопом, а также при пролонгировании в течение 6 часов (протоколы 5–5). 6). Тем не менее, многие исследования продемонстрировали, что лигирование TCR процессированным антигеном индуцирует интернализацию TCR и последующее снижение экспрессии его на клеточной поверхности (19, 34). Действительно, в протоколе 2, в котором стимуляция антигеном выполнялась перед окрашиванием внеклеточного тетрамера, частота тетрамер-положительных клеток была значительно ниже по сравнению с таковой в протоколе 1.

Здесь, используя тетрамеры, специфичные для двух разных антигенов, мы показали эффективность окрашивания тетрамера в пермеабилизированных клетках (протокол 1), что позволяет обнаруживать как поверхностно экспрессируемые, так и интернализованные молекулы TCR, что приводит к идентификации самого высокого процента тетрамера. -связывающие клетки. Эта процедура окрашивала эпитоп-специфический CD4 + T лучше, чем протокол 3, в котором мечение тетрамером выполнялось до стимуляции антигеном. Это может быть связано с меньшей авидностью связывания тетрамера с молекулами TCR в отсутствие активации клеток путем стимуляции антигеном.Действительно, известно, что активация клеток вызывает реорганизацию TCR с образованием больших кластеров молекул TCR (27), которые увеличивают силу связывания тетрамера.

Анализ многофункциональных CD4 + Т-клеток имеет решающее значение для углубленной характеристики иммунных ответов на вакцинацию как в доклинических, так и в клинических исследованиях. Поэтому очень важно иметь протокол, который оптимально сочетает идентификацию антиген-специфических Т-клеток с анализом их цитокинового профиля.Здесь мы показываем возможность комбинировать при стимуляции антигеном тетрамерное и внутриклеточное окрашивание цитокинов в проницаемых клетках, что позволяет идентифицировать большее количество полифункциональных тетрамер-положительных CD4 + Т-клеток. Количество клеток, продуцирующих все четыре цитокина или коэкспрессирующих два или три цитокина (особенно TNF-α, IFN-γ и IL-2), действительно было выше по сравнению с другими протестированными протоколами. Значительно более низкие уровни многофункциональных клеток наблюдались, когда тетрамеры использовались как в качестве стимула, так и в качестве окрашивания (протоколы 4, 5 и 6).В самом деле, даже несмотря на то, что более высокий процент тетрамерсвязывающих Т-клеток был идентифицирован протоколами 5 и 6, около 70% были отрицательными по продукции цитокинов по сравнению с 14%, наблюдаемыми в протоколе 1, демонстрируя, что связывание эпитоп-комплексов класса MHC II к TCR в присутствии костимул CD49d и CD28 недостаточно для эффективной реактивации многофункциональных антиген-специфичных CD4 + Т-клеток.

Функциональная характеристика CD4 + Т-клеток, описанная анализируемыми здесь протоколами, особенно подходит для доклинических исследований, в которых достаточное количество CD4 + Т-клеток может быть легко идентифицировано в дренирующих лимфоидных органах, таких как лимфатические узлы или селезенки, в то время как у людей это обычно более сложно, потому что частота антиген-специфических CD4 + Т-клеток в крови низкая и часто не определяется (6).Более того, использование тетрамеров MHC требует предварительных знаний о пептидном эпитопе и гаплотипе MHC хозяина, ограничение, которое можно легко обойти у инбредных животных.

В заключение, в настоящей работе мы выбрали оптимизированный протокол для идентификации эпитоп-специфичных Т-клеток CD4 + и их эффекторной функции, сочетающий антигенную стимуляцию клеток с внутриклеточным окрашиванием молекул TCR и цитокинов. Антигенная рестимуляция, выполняемая в начале процедуры, позволяет активировать клетки и вызывать множественную продукцию цитокинов, но в то же время она способствует подавлению экспрессии поверхностного TCR, которая устраняется окрашиванием внутриклеточного тетрамера.Эта процедура позволяет также сократить общее время протокола, поскольку окрашивание тетрамера, поверхностного маркера и цитокина объединяется на одном этапе окрашивания.

Этот протокол позволяет лучше понять сложный функциональный профиль Т-клеточного ответа на вакцинацию или естественную инфекцию, и он может быть инструментом для анализа иммунного ответа на вакцинацию.

Заявление о доступности данных

Наборы данных, созданные для этого исследования, доступны по запросу соответствующему автору.

Заявление об этике

Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями Министерства здравоохранения Италии (разрешение № 1004/2015-PR, 22 сентября 2015 г.).

Авторские взносы

GP, DM и AC разработали и разработали эксперименты. GP, MC и EP проводили эксперименты. GP, MC, AC, EP и EN проанализировали данные. Газету написали GP и AC. DM и AC критически отредактировали рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

Финансирование

Это исследование было проведено при финансовой поддержке Комиссии Европейских сообществ, контракта Седьмой рамочной программы HEALTH-2011-280873 Advanced Immunization Technologies (ADITEC) и гранта № 730694 Рамочной программы Horizon 2020 (TRANSVAC).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы выражают признательность NIH Tetramer Core Facility (контракт HHSN272201300006C) за предоставление тетрамеров MHC класса II и Staten Serum Institute за предоставление реагентов H56 и CAF01.

Список литературы

1. Чиабаттини А., Петтини Э., Медаглини Д. Праймирование Т-клеток CD4 ( + ) как биомаркер для изучения иммунного ответа на профилактические вакцины. Фронт Иммунол . (2013) 4: 421. DOI: 10.3389 / fimmu.2013.00421

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

2.Джелли-Гиббс DM, Strutt TM, McKinstry KK, Swain SL. Влияние на судьбу Т-лимфоцитов CD4 на пути к памяти: уроки гриппа. Immunol Cell Biol . (2008) 86: 343–52. DOI: 10.1038 / icb.2008.13

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. Альтман Дж. Д., Мосс П. А., Гоулдер П. Дж., Баруш Д. Х., МакХейзер-Вильямс М. Г., Белл Дж. И. и др. Фенотипический анализ антигенспецифических Т-лимфоцитов. Наука . (1996) 274: 94–6. DOI: 10.1126 / science.274.5284.94

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Мун Дж. Дж., Чу Х. Х., Пеппер М., МакСорли С. Дж., Джеймсон С. К., Кедл Р. М. и др. Частота наивных CD4 (+) Т-клеток варьируется для разных эпитопов и предсказывает разнообразие репертуара и величину ответа. Иммунитет . (2007) 27: 203–13. DOI: 10.1016 / j.immuni.2007.07.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5. Кэмерон Т.О., Норрис П.Дж., Патель А., Мулон С., Розенберг Е.С., Меллинс Э.Д. и др.Мечение антиген-специфических CD4 (+) Т-клеток олигомерами MHC класса II. Дж. Иммунол Методы . (2002) 268: 51–69. DOI: 10.1016 / S0022-1759 (02) 00200-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Воллерс С.С., Стерн Л.Дж. Окрашивание тетрамерами главного комплекса гистосовместимости класса II: успехи, проблемы и перспективы. Иммунология . (2008) 123: 305–13. DOI: 10.1111 / j.1365-2567.2007.02801.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8.Прота G, Кристенсен Д., Андерсен П., Медаглини Д., Чиабаттини А. Пептид-специфические Т-хелперные клетки, идентифицированные тетрамерами MHC класса II, дифференцируются на несколько подтипов после иммунизации составом противотуберкулезной вакцины H56 с адъювантом CAF01. Вакцина . (2015) 33: 6823–30. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2015.09.024

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Чиабаттини А., Петтини Э., Фиорино Ф., Пасторе Дж., Андерсен П., Поцци Дж. И др. Модуляция первичного иммунного ответа различными адъювантами вакцины. Фронт Иммунол . (2016) 7: 427. DOI: 10.3389 / fimmu.2016.00427

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Schmittel A, Keilholz U, Scheibenbogen C. Оценка интерферон-гамма ELISPOT-анализа для количественного определения пептид-специфических Т-лимфоцитов периферической крови. Дж. Иммунол Методы . (1997) 210: 167–74. DOI: 10.1016 / S0022-1759 (97) 00184-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11.Фрир Г., Ринди Л. Обнаружение внутриклеточных цитокинов с помощью флуоресцентной проточной цитометрии: основные принципы и последние достижения. Методы . (2013) 61: 30–8. DOI: 10.1016 / j.ymeth.2013.03.035

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Де Роса С.К., Лу FX, Ю Дж., Перфетто С.П., Фаллун Дж., Мозер С. и др. Вакцинация у людей вызывает широкий ответ цитокинов Т-клеток. Дж. Иммунол . (2004) 173: 5372–80. DOI: 10.4049 / jimmunol.173.9.5372

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13.Darrah PA, Patel DT, De Luca PM, Lindsay RWB, Davey DF, Flynn BJ и др. Многофункциональные клетки Th2 определяют коррелят опосредованной вакциной защиты от Leishmania major. Нат Мед . (2007) 13: 843–50. DOI: 10,1038 / нм1592

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Линденстрём Т., Аггер Е.М., Корсхольм К.С., Дарра П.А., Аагаард С., Седер Р.А. и др. Субъединичная вакцинация против туберкулеза обеспечивает долгосрочный защитный иммунитет, характеризующийся многофункциональными Т-клетками памяти CD4. Дж. Иммунол . (2009) 182: 8047–55. DOI: 10.4049 / jimmunol.0801592

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Деррик С.К., Ябе И.М., Ян А., Моррис С.Л. Вызванный вакциной противотуберкулезный защитный иммунитет у мышей коррелирует с величиной и качеством многофункциональных Т-лимфоцитов CD4. Вакцина . (2011) 29: 2902–9. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2011.02.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17.Чилиан Э.З., Дезель С., Форбс Э.К., Бандерманн С., Сандер С.Р., Хилл АВС и др. Иммуногенность и защитная эффективность схем прайм-буста с рекомбинантным (дельта) ureC hly + Mycobacterium bovis BCG и модифицированным вирусом осповакцины ankara, экспрессирующим антиген 85A M. tuberculosis против туберкулеза мышей. Заражение иммунной . (2009) 77: 622–31. DOI: 10.1128 / IAI.00685-08

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Caccamo N, Guggino G, Joosten SA, Gelsomino G, Di Carlo P, Titone L, et al.Многофункциональные CD4 (+) Т-клетки коррелируют с активной инфекцией Mycobacterium tuberculosis . Eur J Immunol . (2010) 40: 2211–20. DOI: 10.1002 / eji.201040455

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Лю Х., Родос М., Вист Д.Л., Виньяли Д.А. О динамике экспрессии и подавления экспрессии комплекса CD3 на поверхности клетки TCR: CD3. Иммунитет . (2000) 13: 665–75. DOI: 10.1016 / S1074-7613 (00) 00066-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20.Aagaard C, Hoang T, Dietrich J, Cardona P-J, Izzo A, Dolganov G, et al. Многоступенчатая противотуберкулезная вакцина, обеспечивающая эффективную защиту до и после заражения. Нат Мед . (2011) 17: 189–94. DOI: 10,1038 / нм.2285

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Аггер Э.М., Розенкрандс И., Хансен Дж., Брахими К., Вандал Б.С., Аагаард С. и др. Катионные липосомы с синтетическим микобактериальным кордфактором (CAF01): универсальный адъювант для вакцин с различными иммунологическими требованиями. PLOS ONE . (2008) 3: e3116. DOI: 10.1371 / journal.pone.0003116

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Ciabattini A, Prota G, Christensen D, Andersen P, Pozzi G, Medaglini D. Характеристика антиген-специфичного ответа CD4 (+) Т-клеток, индуцированного стратегиями первичной бустерной адъюванта CAF01 и CpG, вводимых интраназально и через нос. подкожные пути. Фронт Иммунол . (2015) 6: 430. DOI: 10.3389 / fimmu.2015.00430

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23.Чиабаттини А., Петтини Э., Фиорино Ф., Луччеси С., Пасторе Дж., Брунетти Дж. И др. Гетерологические комбинации прайм-буста подчеркивают решающую роль адъюванта в праймировании иммунной системы. Фронт Иммунол . (2018) 9: 380. DOI: 10.3389 / fimmu.2018.00380

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Санторо Ф., Петтини Э., Казмин Д., Чиабаттини А., Фиорино Ф., Гилфиллан Г. Д. и др. Транскриптомика иммунного ответа на вакцину: праймирование с адъювантом модулирует врожденные ответы после бустинга. Фронт Иммунол . (2018) 9: 1248. DOI: 10.3389 / fimmu.2018.01248

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Moon JJ, Dash P, Oguin TH, McClaren JL, Chu HH, Thomas PG и др. Количественное влияние отбора тимуса на Foxp3 + и Foxp3– субпопуляции селф-пептидов / MHC класса II CD4 + Т-клеток. Proc Natl Acad Sci USA . (2011) 108: 14602–7. DOI: 10.1073 / pnas.1109806108

CrossRef Полный текст | Google Scholar

26.Беннеков Т., Дитрих Дж., Розенкрандс И., Стрин А., Доэрти Т.М., Андерсен П. Изменение паттерна распознавания эпитопа в Ag85B и ESAT-6 оказывает глубокое влияние на индуцированную вакциной защиту против Mycobacterium tuberculosis . Eur J Immunol . (2006) 36: 3346–55. DOI: 10.1002 / eji.200636128

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Чеккони В., Моро М., Дель Маре С., Деллабона П., Казорати Г. Использование тетрамеров MHC класса II для исследования ответов Т-лимфоцитов CD4 + : проблемы и решения. Цитометрия А . (2008) 73: 1010–8. DOI: 10.1002 / cyto.a.20603

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Аппей В., Никсон Д.Ф., Донахью С.М., Гиллеспи Г.МА., Донг Т., Кинг А. и др. ВИЧ-специфические Т-клетки Cd8 + продуцируют противовирусные цитокины, но их цитолитическая функция нарушена. J Exp Med . (2000) 192: 63–76. DOI: 10.1084 / jem.192.1.63

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Wilmschen S, Banki Z, Laer D von, Kimpel J.Одновременная количественная оценка анти-векторных и анти-трансген-специфичных Т-клеток CD8 + с помощью окрашивания тетрамером MHC I после вакцинации вирусным вектором. J Vis Exp . (2018) 141: e58680. DOI: 10.3791 / 58680

CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Хан Ю.В., Алеяс А.Г., Джордж Дж. А., Юн Х. А., Ли Дж. Х., Ким Б. С. и др. Внутриклеточная экспрессия CD154 отражает антиген-специфические CD8 + Т-клетки, но проявляет меньшую чувствительность, чем окрашивание внутриклеточных цитокинов и тетрамеров MHC. Дж. Микробиол Биотехнология . (2007) 17: 1955–64.

PubMed Аннотация | Google Scholar

31. Мейер А.Л., Тролльмо С., Кроуфорд Ф., Маррак П., Стир А.С., Хубер Б.Т. и др. Прямой подсчет Borrelia-реактивных CD4 Т-клеток ex vivo с использованием тетрамеров MHC класса II. Proc Natl Acad Sci USA . (2000) 97: 11433–8. DOI: 10.1073 / pnas.1897

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

32. Uchtenhagen H, Rims C, Blahnik G, Chow I-T, Kwok WW, Buckner JH, et al.Эффективный анализ ex vivo CD4 + Т-клеточных ответов с использованием комбинаторного окрашивания тетрамеров HLA класса II. Нац Коммуна . (2016) 7: 12614. DOI: 10.1038 / ncomms12614

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

33. Tesfa L, Volk HD, Kern F. Протокол для комбинирования пролиферации, окрашивания тетрамеров и определения внутриклеточных цитокинов для проточно-цитометрического анализа антигенспецифических Т-клеток. Хомеост-агенты J Biol Regul .(2003) 17: 366–70.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Познакомьтесь с известным гималайским альпинистом Симоне Моро

Поход Симоне Моро на Нанга Парбат, известный как «Гора Убийц». Фотография любезно предоставлена ​​Симоне Моро

Пожалуйста, соблюдайте авторские права. Несанкционированное использование запрещено.

Барбара Моро, учитель физкультуры в средней школе в Бергамо, Италия, однажды пришла домой с работы и рассказала своему мужу, Симоне Моро, известному гималайскому альпинисту, что одна из ее учениц подала большие надежды и интерес стать альпинистом-высотником.Во-первых, ученица обладала даром выносливости, но при этом она была уважительной и зрелой. Она очень любила горы.

Студентка Тамара Лунгер выросла, катаясь на лыжах и занимаясь скалолазанием в Доломитовых Альпах, окружающих ее дом, город Больцано, в Южном Тироле. Ее отец, Хансйорг Лунгер, был местной легендой горнолыжного спорта и ее первым учителем.

Прислушиваясь к совету жены, Симона пригласил Тамару присоединиться к нему в экспедиции в Гималаи в 2009 году, когда Тамаре было 22. Их целью было 8 188 метров (26 864 фута) Чо Ойю, шестая по высоте гора в мире.Но в том году Китай закрыл границу между Тибетом и Непалом, и им так и не удалось подняться. Тем не менее, этот опыт открыл глаза, подтвердив решение Тамары посвятить свою жизнь скалолазанию.

Тамара вернулась в следующем году одна и в одиночку преодолела Чо-Ойю на высоту 7750 метров, прежде чем развернуться. Но признание, которое заслужила Тамара за то, что так далеко, было омрачено трагедией. Уолтер Нонс, еще один альпинист и один из друзей Тамары, погиб на той же вершине. Тамара помогла с восстановлением тела, опыт, который, по ее словам, «лишил меня любви к горам.

Но медленно она вернулась.

Барбара Моро была права. У Тамары явно было все, что нужно, чтобы стать альпинисткой.

Несмотря на чрезмерную коммерциализацию многих самых выдающихся вершин мира, восхождение на них «правильным путем» по-прежнему требует высокого уровня навыков, физической подготовки, уважения и уверенности в себе - давних принципов альпинизма. Это своего рода неписаный этический кодекс, более важный, чем количество собранных вершин, которого настоящие альпинисты продолжают придерживаться.

Перенесемся в середину утра 26 февраля 2016 года по пакистанскому времени: Тамара Лунгер и Симоне Моро, которым 29 и 48 лет соответственно, оказались в нескольких сотнях метров ниже вершины Нанга Парбат. Они находятся в непосредственной близости от того, чтобы войти в историю и завершить долгожданное первое зимнее восхождение на гору; то есть восхождение на гору впервые происходит в течение календарной зимы со всеми дополнительными проблемами, которые приносит зима, такими как намного более низкие температуры

, непрекращающиеся муссонные штормы и склоны с высокой склонностью к лавинам.

Они присоединились к двум другим альпинистам из другой экспедиции: Алекс Чикон из Испании и Мухаммед Али из Садпара, Пакистан (он же Али Садпара). Все четверо альпинистов передвигаются независимо. Никто не несет даже веревки.

Примерно в 100 метрах (300 футов) ниже вершины Тамара признается Симоне, что она, возможно, не сможет спуститься сама.

«Она сказала мне:« Я могу добраться до вершины… Но если я это сделаю, я не думаю, что смогу спуститься без вашей помощи », - говорит Симона.«Это был довольно тревожный приговор! У нас не было веревки, поэтому она доставила бы нам всем массу неприятностей, если бы мы помогли ей спуститься.

Тамара Лунгер (слева) и Симоне Моро в палатке во время зимнего восхождения на Нанга Парбат в феврале 2016 года; Фотография любезно предоставлена ​​Симоне Моро

Пожалуйста, соблюдайте авторские права. Несанкционированное использование запрещено.

Накануне вечером четверка делила палатку на плече гималайского гиганта на высоте 7 100 метров. По нормальным гималайским стандартам альпинизма, ни один из четырех альпинистов не был должным образом акклиматизирован из-за общего характера зимних восхождений в Гималаях, когда сезонные муссонные струйные потоки опустошают горы и удерживают альпинистов в основном в палатках.Разумеется, за предыдущие 80 дней по крайней мере дюжина или около того альпинистов, состоявших по крайней мере из пяти различных экспедиций - все они боролись за желанное первое зимнее восхождение на Нанга Парбат - терпеливо ждали в базовом лагере, пока шторм за штормом разрывали «голую» саммит.

Действительно, это одна из многих причин, по которым Нанга Парбат, несмотря на более чем 30 попыток за последние три десятилетия, оставался непокоренным зимой: окна хорошей погоды, если они когда-либо наступят, слишком коротки, чтобы позволить правильная акклиматизация, тем более заявка на саммит.

Тем не менее, маловероятная четверка альпинистов оказалась на бивуаке примерно в тысяче метров ниже вершины, и впереди был день хорошей погоды. Наступил день саммита. Они приняли решение уехать в 6 часов утра, а не в 3 часа ночи. Они были на западной стороне горы, и при постоянном ветре 30 миль в час и морозе до минус 80ºF, они хотели максимизировать свои время на солнце.

Тамара проснулась истощенная. Ее вырвало завтраком. Она не могла ничего удерживать, даже воду.Высота сказывалась. Тем не менее, она поднялась вместе со своим наставником и двумя новообретенными друзьями.

Если бы Тамара смогла подняться на вершину, она стала бы первой женщиной, совершившей первое зимнее восхождение на 8000-метровую вершину. Фактически, только 27 человек когда-либо стояли зимой на вершине 8000 метров, и только одна из них - женщина. В 1993 году Марианна Шапюиза из Швейцарии совершила зимнее восхождение на Чо-Ойю - второе зимнее восхождение на вершину .

В 3:37 п.м. Али Садпара, пакистанский носильщик без крупных спонсоров, стал первым, кто встал на вершину Нанга Парбат зимой. Это был его четвертый раз на вершине Нанга Парбат, рекорд.

Вскоре к нему присоединились Симоне Моро и Алекс Тксикон.

Тем временем, всего в 70 метрах от них, Тамара остановилась. Альпинисты были достаточно близко, чтобы помахать друг другу.

«Честно говоря, мы думали, что она поднимется на вершину», - говорит Симона. «Она была так близко - всего в 20 или 30 минутах от вершины.Но она была совершенно без власти. У нее было обезвоживание, и она знала, что подъем выше может подвергнуть опасности и нас. Потому что мы тоже были истощены ».

Мужчины провели на вершине меньше нескольких минут. Сфотографировала только Симона. Тем временем Тамара развернулась и спустилась одна, самостоятельно.

«Впервые за всю свою карьеру в скалолазании я увидел такой умный, щедрый и этичный образ мышления в горах», - говорит Симона. «Это был бы исторический момент в альпинизме: она собиралась стать первой женщиной, совершившей первое зимнее восхождение на 8000-метровую вершину.Но она думала о нас.

«Это была одна из самых невероятных вещей, которые я когда-либо видел в скалолазании».

В тот вечер четверо альпинистов вернулись в лагерь 4, а на следующий день все вернулись в базовый лагерь.

На данный момент только одна из 14 самых высоких вершин в мире - горы с высотой, превышающей 8000 метров - ожидает зимнего восхождения: К2, вторая по высоте гора на Земле и, по статистике, одна из самых смертоносных.

Симоне Моро во время зимнего восхождения на Нанга Парбат в феврале 2016 г .; Фотография любезно предоставлена ​​Симоне Моро

Пожалуйста, соблюдайте авторские права.Несанкционированное использование запрещено.

Симоне Моро - харизматичная фигура, огромная, чем он есть, чьи заостренные зубы и очкастое лицо противоречат сверхчеловеческой выносливости и способности страдать - чертам, которые позволили ему подняться на многочисленные 8000-метровые вершины, в том числе четыре зимой, - рекорд. Профессиональный альпинист и пилот высотного вертолета, который является пионером в разработке новых средств для выполнения чрезвычайно опасных, рискованных и спорных спасательных операций альпинистов на высоте, Симона поговорила с нами после того, как они с Тамарой достигли Исламабада, где им обоим была оказана медицинская помощь по поводу пальцев ног. - обмороженные, но неповрежденные и ожидается, что они полностью выздоровеют.

Каково это, совершив первое зимнее восхождение на Нанга Парбат?

Честно говоря, Алекс, Али и я с трудом не считали Тамару вершиной, как мы. Мы были на 100 процентов уверены, что она приближается к вершине, потому что расстояние, на котором она остановилась и повернула назад, было очень маленьким. Она была всего на 70 метров ниже нас. Мы могли бы ей помахать. Но она действительно была совершенно измотана, и все утро у нее были проблемы с желудком.

Как я уже сказал, впервые в моей альпинистской карьере я увидел такой щедрый и очень умный образ мышления.Она отказалась от встречи на высшем уровне, чтобы не подвергнуть нас опасности. Это как если бы вы были близки к завоеванию олимпийской медали, и за два метра до финиша вы останавливаетесь, разворачиваетесь и помогаете кому-то в беде. Это было действительно невероятно.

С какими трудностями вы столкнулись на этом восхождении?

Во-первых, мы не акклиматизировались должным образом, когда решили ухватиться за окно хорошей погоды и отправиться на вершину. В лагере 2 мы провели всего одну ночь на высоте 6200 метров.Обычно этого недостаточно для восхождения на пик высотой 8000 метров без кислорода. Итак, это был первый большой вопросительный знак: сможем ли мы подняться на вершину всего за одну ночь в 6200?

Второй серьезной проблемой были погода и ветер. Ветер был 45 километров в час [30 миль в час], а ветер был минус 60 градусов по Цельсию (-76 градусов по Фаренгейту).

Плохая акклиматизация и холод могли убить чьи-либо амбиции, и нам пришлось серьезно бороться с этими элементами. Вначале мы двигались довольно быстро, но я помню, что последние 200 метров до вершины это была действительно чисто мысленная игра.

Вы с Тамарой изначально ехали по маршруту Месснера, но вы перешли на Али и Тхикон по маршруту Кинсхофер. Почему вы поменяли цели?

Изначально идея заключалась в том, чтобы попробовать маршрут, не требующий фиксированных веревок. Я уже пробовал маршрут Месснера зимой 2011 года с Денисом Урбуко и понял, что это идеальный маршрут для достижения вершины Нанга Парбат без каких-либо фиксированных веревок.

В этом году еще одна команда (Томаш Мацкевич из Польши и Элизабет Револь из Франции) пробовала этот маршрут.Они предупредили меня о том, что в этом сезоне было много трещин и падающих сераков, так что это было довольно опасно.

Именно тогда я решил принять приглашение Алекса присоединиться к нему и его партнерам. Я понял, что маршрут Киншофера - единственный реальный путь в этом году.

Так Алекс пригласил? Кроме того, это означало использование фиксированных веревок для достижения вершины, верно?

Я знаю Алекса с 2003 года, когда я поднялся на Броуд Пик, и он был в базовом лагере.Так что с тех пор мы дружим. Он пригласил меня в начале экспедиции. Он сказал: «Симона, зимой ты здесь самый опытный парень, так что отправляйся с нами по маршруту Киншофера». Сначала я отказался, сказав, что нет, позвольте мне попробовать маршрут Месснера. Но когда я понял, что это слишком опасно, я присоединился к нему и поблагодарил его.

Алекс и Али сделали 70 процентов работы, закрепив веревки. Так что у нас было преимущество присоединиться к ним и воспользоваться той фантастической работой, которую они проделали.
Я попытался отплатить им, скажем, предложив весь свой опыт и стратегию выше на горе.Знаете, в жизни иногда именно сочетание правильной команды, правильных условий позволяет человеку достичь цели.

Почему вас тянет к восхождению на 8000-метровые вершины зимой?

Вы лучше меня знаете, что если вы хотите показать всему миру, что вы очень хороший высотный альпинист, вам нужно покорить все 14 вершин высотой 8000 метров. Сейчас в мире около 40 человек сделали это. Да, это дорого, рискованно, долго и сложно.Но, конечно же, восхождение на 14 8000ers больше не является своего рода исследованием. Когда это сделали почти 40 человек, становится очевидным, что это возможно.

Вместо того, чтобы гнаться за 14-ю, я обнаружил, что восхождение на 8000-метровые вершины зимой - это настоящее, чистое, абсолютное исследование. У вас 15 процентов успеха. Честно говоря, позвольте мне спросить вас: как вы думаете, удобно или разумно сегодня, когда спонсоры и пресса требуют успешных экспедиций, выбирать то, что имеет более 85 процентов неудач?

Но я делаю это, потому что чувство исследования очень велико.Вы избегаете ловушки успеха и просто принимаете красоту большого вопросительного знака. Должен признаться, я счастлив, что не попал в ловушку, скажем так, жажды успеха. Я жажду исследований. А когда едешь зимой, даже оставаясь в базовом лагере три месяца в ожидании хорошей погоды, действительно чувствуешь себя первопроходцем. Как исследователь другого времени.

Зимой вы взошли на четыре из 14 вершин высотой 8000 метров. Вы сделаете остальные 10?

Абсолютно нет! Во-первых, я слишком стар.Мне 48 лет. А во-вторых, я слишком умен, потому что знаю, как это будет сложно. Но наверняка рано или поздно найдется кто-то, кто предложит другой способ сбора 8000ers. Вместо 41-го или 42-го номера, выполнившего все 14, они могли бы первыми сделать их зимой. Это произойдет.

А как насчет K2, последнего оставшегося 8000er без зимнего восхождения?

Нет, я не буду пробовать К2, и позвольте мне объяснить вам, почему: когда я поднимался на Гашербрум II зимой, моей жене приснился сон.И в этом сне я умирал во время зимнего восхождения на К2. Поэтому, когда я пришел домой, она сказала мне: «Я никогда не говорила тебе, что ты должен или не должен лазить или что ты должен делать. Но позвольте мне спросить вас только об одном. Никогда не переходи на K2 ».

Итак, я не хочу идти и смотреть, права она или нет!

Зимой на К2 готовится большая польская экспедиция. Было бы здорово, счастливый конец, потому что изобретателями этой игры в зимний альпинизм были поляки.Они были первыми, кто поднялся на 8000-й зимой вместе с Эверестом в 1980 году, и для них было бы неплохо завершить этот период.

Что дальше?

Я точно не ухожу на пенсию. Но зимой перестану лазить на 8000. Хочу что-то поменять и вернуться к техническому альпинизму. Я очень очарован множеством непокоренных вершин 7000 метров и ниже.

Человеку из Техаса предъявлено обвинение в доставке метамфетамина

ЭДВАРДСВИЛЛ. В четверг прокуратура округа Мэдисон предъявила обвинение в отношении метамфетамина класса X мужчине из Техаса, что является одним из ряда обвинений, связанных с наркотиками.

Марлон Х. ВанХук, 43 года, из Остина, штат Техас, был обвинен 13 мая в незаконном хранении с целью доставки метамфетамина, что является тяжким преступлением класса X.

Дело было представлено полицейским управлением Хайленда.

Согласно судебным документам, 5 мая у ВанХука якобы было обнаружено от 15 до 100 граммов метамфетамина с намерением доставить его.

Залог был установлен в размере 150 000 долларов.

Другие обвинения, связанные с наркотиками, поданные 13 мая прокуратурой округа Мэдисон, включают:

• Мэтью Э.Бэнди, 41 год, и Келси Л. Хенке, 30 лет, оба из 7400 квартала Олд Моро-роуд, Моро, были обвинены в незаконном хранении метамфетамина, оба преступления класса 2. Дела были представлены департаментом шерифа округа Мэдисон. 12 мая у двоих якобы было обнаружено от 5 до 15 граммов метамфетамина. Залог был установлен в размере 50 000 долларов каждый.

• Майкл С. Кауфман, 40 лет, из Трентона, был обвинен в незаконном хранении метамфетамина, уголовном преступлении класса 3; и два пункта обвинения в незаконном хранении контролируемого вещества, оба являются уголовными преступлениями класса 4.Дело было представлено полицейским управлением Хайленда. 9 апреля у Кауфмана якобы было обнаружено менее пяти граммов метамфетамина; и менее 15 граммов каждого из алпразолама и лоразепама. Залог был установлен в размере 25 000 долларов.

• 42-летняя Эмили Дж. Каннингем из Эдвардсвилля была обвинена в незаконном хранении метамфетамина, уголовном преступлении класса 3; и незаконное владение контролируемым веществом, уголовное преступление 4 класса. Дело было представлено полицейским управлением Вуд-Ривер.12 мая у Каннингема якобы было обнаружено менее пяти граммов метамфетамина и менее 15 граммов фентанила. Залог был установлен в размере 15 000 долларов.

• Дженис И. Буркхардт, 55 лет, из Ист-Олтона, была обвинена в незаконном хранении метамфетамина, преступлении класса 3. Дело было представлено департаментом шерифа округа Мэдисон. 12 мая у Буркхардта якобы было обнаружено менее пяти граммов метамфетамина. Залог был установлен в размере 15 000 долларов.

• Марк Э. Кэмерон, 49 лет, из Хайленда, был обвинен в незаконном хранении метамфетамина, что является тяжким преступлением класса 3. Дело было представлено полицейским управлением Хайленда. 27 апреля у Кэмерона якобы было обнаружено менее пяти граммов метамфетамина. Залог был установлен в размере 15 000 долларов.

• Тайлер М. Каннингем, 19 лет, из Ист-Альтона, был обвинен в незаконном хранении метамфетамина, уголовном преступлении класса 3. Дело было представлено полицейским управлением Ист-Олтона.12 мая у Каннингема якобы было обнаружено менее пяти граммов метамфетамина. Залог был установлен в размере 15 000 долларов.

• Гидеон Т.

©2021 «Детская школа искусств» Мошенского муниципального района